DB34-T 4203-2022 豬腸外致病性大腸桿菌分離鑒定規(guī)程

ICS

11.220CCS

B

4134 DB34/T

4203—2022豬腸外致病性大腸桿菌分離鑒定規(guī)程Regulation

of

pathogenic

coli

swine

發(fā)布

實(shí)施安徽省市場監(jiān)督管理局 發(fā)

布DB34/T

4203—2022 本文件按照GB/T

1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則

第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)提出。本文件由安徽省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳歸口。獸醫(yī)站，安徽省豬業(yè)協(xié)會。芳，孫裴，何長生，高亞飛，陳田梅。DB34/T

4203—20221 范圍物無害化處理與人員安全防護(hù)。本文件適用于豬腸外致病性大腸桿菌的分離鑒定。2規(guī)范性引用文件文件。GB

4789.6 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)

食品微生物學(xué)檢驗(yàn)

致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)GB

4789.38 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)

食品微生物學(xué)檢驗(yàn)

大腸埃希氏菌計數(shù)GB

4789.41 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)

食品微生物學(xué)檢驗(yàn)

腸桿菌科檢驗(yàn)GB

19489 實(shí)驗(yàn)室

生物安全通用要求SN/T

2025 動物檢疫實(shí)驗(yàn)室生物安全操作規(guī)范SN/T

2984 檢驗(yàn)檢疫動物病原微生物實(shí)驗(yàn)活動生物安全要求細(xì)則3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。腸外致病性大腸桿菌

pathogenic

Escherichia

coli，ExPEC血癥或局部腸道外感染的大腸桿菌。4 主要設(shè)備和材料顯微鏡：10×～100×。電子天平：感量

0.1

g。恒溫培養(yǎng)箱：37℃。冰箱：0℃～4℃。無菌培養(yǎng)皿：直徑

mm

或

90

mm。無菌試管：12

×

，15

×

。麥?zhǔn)媳葷峁?。pH

pH

比色管或精密

試紙。飽和氯化鈉溶液：見附錄

A

中

。30％甘油緩沖鹽水溶液：見附錄

A

中

A.2。DB34/T

4203—2022麥康凱培養(yǎng)基（MAC

GB

4789.6

規(guī)定執(zhí)行。革蘭氏染色液：按照

GB

4789.41

規(guī)定執(zhí)行。三糖鐵（）瓊脂斜面培養(yǎng)基：按照

GB

4789.6

規(guī)定執(zhí)行。蛋白胨水和靛基質(zhì)試劑：按照

4789.6

緩沖葡萄糖蛋白胨水和甲基紅試劑、V-P

試劑：按照

GB

4789.38

規(guī)定執(zhí)行。枸櫞酸鹽培養(yǎng)基：按照

4789.38

規(guī)定執(zhí)行。LB

固體培養(yǎng)基：見附錄

A

中

A.3。試驗(yàn)小鼠：6～8

18

g～

g，清潔級。大腸桿菌

O

抗原單因子標(biāo)準(zhǔn)血清。5 操作規(guī)程操作流程ExPEC分離鑒定的流程示意圖見附錄B。操作步驟5.2.1 樣品采集5.2.1.1 采集：無菌操作采集病豬的肝臟、肺臟、脾臟、淋巴結(jié)、腦等腸外組織，或關(guān)節(jié)積液、心包積液。5.2.1.2 保存與運(yùn)輸：病料樣品采集后不能及時送檢的，可保存于飽和氯化鈉溶液或

30％

甘油緩沖鹽水溶液中，保存時間不超過

h。樣品均需采取低溫（0℃～4℃）保存和運(yùn)輸。5.2.2 細(xì)菌分離與純化MAC37℃培養(yǎng)

h～24

h落呈鮮桃紅色或粉紅色，中等大小，直徑

1.0

～2.5

mm，圓形，邊緣整齊，表面光滑）再次劃線接種于，℃

培養(yǎng)

18

h～24

h

（即純化）后進(jìn)行大腸桿菌鑒定。5.2.3 腸外大腸桿菌鑒定5.2.3.1 形態(tài)特征鑒定：革蘭氏染色鏡檢。大腸桿菌為革蘭氏陰性直短桿菌，兩端鈍圓，無芽孢，多散在，也有成對排列。5.2.3.2 生化特性鑒定：先取純化菌落接種三糖鐵（）瓊脂斜面培養(yǎng)基，37℃

18

h～

h。

H2S糖蛋白胨水、枸櫞酸鹽培養(yǎng)基，37℃

18

h～

h，進(jìn)行吲哚試驗(yàn)（I）、甲基紅試驗(yàn)（MRP

試驗(yàn)（Vi）、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)（C），簡稱

試驗(yàn)。大腸桿菌為

＋

＋

－

－。按照

4789.38、

4789.6

5.2.4 腸外大腸桿菌致病性鑒定取10

5

5.2.3中兩條鑒定均符合的大腸桿菌分離株制成濃度約為

0.3

mL鼠每只腹腔注射

0.3

mL

用于稀釋菌液的無菌生理鹽水。注射后觀察

3

d

內(nèi)小鼠精神狀況及死亡情并將死亡的小鼠在無菌操作下取其肺臟、肝臟、脾臟組織分別接種于，℃

培養(yǎng)

24

h，挑取大腸DB34/T

4203—2022TSIIMViC試驗(yàn)，結(jié)果與接種菌株一致則說明待檢大腸桿菌分離株為ExPEC。5.2.5 腸外致病性大腸桿菌

O

抗原血清型鑒定見附錄C。5.2.6 腸外致病性大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化群鑒定見附錄D。6 結(jié)果報告符合

5.2.2，5.2.3，，可確定為

ExPEC。符合

，且根據(jù)

5.2.5，可確定為某種

O

抗原血清型的

ExPCE。符合

，且根據(jù)

5.2.6，可確定為某種系統(tǒng)進(jìn)化群的

ExPCE。7廢棄物無害化處理與人員安全防護(hù)應(yīng)按照

GB

19489、SN/T

2984

和

SN/T

2025

的規(guī)定執(zhí)行。DB34/T

4203—2022附 錄 A（資料性）培養(yǎng)基的配制A.1 飽和氯化鈉溶液A.1.1 成分氯化鈉 38.0

g～

g蒸餾水 100

mLA.1.2制法將

g～

g

氯化鈉加入

蒸餾水中，充分?jǐn)嚢?，待完全溶解混勻后，分裝于采樣管，每管

5

mL～10

mL，℃

高壓滅菌

15

備用。A.230％甘油緩沖鹽水溶液A.2.1 成分氯化鈉 0.5

g堿性磷酸鈉 1.0

g中性甘油 30

mL蒸餾水 100

A.2.2 制法5

mL～

mL，℃高壓滅菌15

min

備用。A.3 LB

固體培養(yǎng)基A.3.1 成分胰蛋白胨 10.0

g酵母提取物 5.0

g氯化鈉 10.0

g瓊脂 15.0

g～20.0

g蒸餾水 1000

mLA.3.2 制法將

A.3.1

中各成分溶于蒸餾水中，加熱溶解，校正至

±0.2，℃滅菌

20

min，待冷卻至50℃

左右時傾注平板。DB34/T

4203—2022附 錄 B（資料性）豬腸外致病性大腸桿菌分離鑒定流程見圖。檢

樣麥康凱培養(yǎng)基分離培養(yǎng)（菌落呈鮮紅色或粉紅色，中等大小，直徑

～2.5

mm，圓形，邊緣整齊，表面光滑）選取可疑菌落涂片鏡檢、純培養(yǎng)（革蘭氏陰性直短桿菌，兩端鈍圓，無芽孢，多散在，也有成對排列）生化試驗(yàn)（TSI：斜面和底面均變黃或變紅，產(chǎn)氣，不產(chǎn)

H2S。IMViC

+ + - -）腸外大腸桿菌動物試驗(yàn)?zāi)c外致病性大腸桿菌O

抗原血清型

系統(tǒng)進(jìn)化群

PCR

鑒定腸外致病性大腸桿菌結(jié)果報告圖B.1

豬腸外致病性大腸桿菌分離鑒定流程+++++++++DB34/T

4203—2022附 錄 C（資料性）豬腸外致病性大腸桿菌

O

抗原血清型鑒定C.1 ExPEC

的

O

抗原制備將ExPEC接種于固體培養(yǎng)基上，37℃

培養(yǎng)

18

h～24

h，用

0.5％

石炭酸生理鹽水將菌苔洗下，置于試管中，制成濃稠的懸液，℃

高壓滅菌

2

h，破壞其K抗原，即為O抗原，儲存于

4℃?zhèn)溆?。C.2 ExPEC

的

O

抗原玻片凝集試驗(yàn)取O抗原分別與大腸桿菌的O抗原單因子血清進(jìn)行玻片凝集反應(yīng)。即O抗原和O抗原單因子血清各取15

μL

在玻片上混勻，2

min

內(nèi)出現(xiàn)明顯凝集者為陽性反應(yīng)。同時以O(shè)抗原與

0.5％

石炭酸生理鹽水混合物作對照，觀察有無自凝集現(xiàn)象玻片凝集試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)見表C.1。表C.1

玻片凝集試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)C.3 ExPEC

的

表C.1

玻片凝集試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)過玻板凝集試驗(yàn)初步篩選可能的OO清的試管凝集價

≥1:640。其步驟如下：a)

O

抗原單因子定型血清的稀釋：采取倍比稀釋法。取潔凈試管

8

支并標(biāo)記，每支試管用移液器加入

0.5mL

％

石炭酸生理鹽水。用移液器吸取

1:10

稀釋的大腸桿菌抗

O

因子血清0.5

mL

加入第

1

管，在管內(nèi)反復(fù)吹打

6～8

次，使血清與生理鹽水充分混合，然后吸取

mL

加入第

2

管，同樣混合均勻后吸取

0.5

mL

加入第

3

管，重復(fù)上次操作，直至第

7

勻后從第

7

管中吸取

0.5

mL

棄去。第

8

管不加血清作為對照。此時從第

1

管到第

7

清稀釋倍數(shù)分別是

1:20，1:40，1:80，1:160，，1:640，1:1280；b)

加入抗原：向各支試管中分別加入

O

抗原，此時血清稀釋倍數(shù)相應(yīng)增大一倍；c)

℃

水浴鍋

4

h

d)

結(jié)果判定如下：1)

生理鹽水對照管中的抗原應(yīng)分散，無凝集塊沉淀，并呈混濁懸液；2)

輕搖即浮起，呈片塊狀；3)

“＋”“”（50的最高血清稀釋度為抗血清的凝集價；? “＋＋＋＋”液體完全透明，100％凝集，管底出現(xiàn)大片的傘狀沉淀，震蕩時呈大片絮狀，但可打碎成小絮片狀；? “＋＋＋”液體幾乎透明，％凝集，管底有明顯的傘狀沉淀，震蕩時呈小或大絮片狀；DB34/T

4203—2022? “＋＋”液體中等混濁，50％凝集，管底有中等量的傘狀沉淀，震蕩時呈小絮片狀；?“＋”液體透明度不明顯，％凝集，管底有少許不明顯的傘狀沉淀；? “－”底中央出現(xiàn)圓點(diǎn)狀沉淀，震蕩時呈均勻混濁狀態(tài)。5'-3bpchuAchuA-FchuA-R279yjaAyjaA-yjaA-152DB34/T

4203—2022附 錄 D（資料性）豬腸外致病性大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化群

D.1 材料準(zhǔn)備D.1.1 主要儀器PCR擴(kuò)增儀、

mL

離心管、

統(tǒng)、移液器、移液器吸管。D.1.2 主要試劑2×

Master

Mix、超純水、瓊脂糖、溴化乙錠（EB

緩沖液、上樣緩沖液（10×Loading

Buffer）、相對分子質(zhì)量Marker（D.1.3 引物序列豬腸外致病性大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化群D.1。表D.1

豬腸外致病性大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化群表D.1

豬腸外致病性大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)化群

鑒定用引物D.2.1ExPEC基因組DNA的提取采用煮沸法。即取

1

mL

培養(yǎng)

20

h

mL

離心管中，以

12000

r/min

離心5min

50

μL

超純水混均，置沸水中煮沸

10

，之后冰浴

5

min，再煮沸

5

，以

12000

r/min

5

，取上清液即為D.2.2 ExPEC的系統(tǒng)進(jìn)化群分群基因PCR擴(kuò)增D.2.2.1

A、B1、B2、D

白對照為滅菌超純水。D.2.2.2 PCR

反應(yīng)體系：總體積為

25

μL，其中含有

12.5

μL

的

PCR

，10

μmol/L上、下游引物各

1

μL，1

μg/L

2

μL，滅菌超純水

μL。D.2.2.3 PCR

℃

5

94℃

45s

60℃

s

72℃

s環(huán)

35

次；72℃終延伸

5

。D.2.3 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測DB34/T

4203—2022D.2.3.1 用

100

mL

1×TAE

緩沖液制備

％

瓊脂糖凝膠，加入

5

μL

10

mg/mL

。D.2.3.2 取

5

μL

PCR

擴(kuò)增產(chǎn)物與

1

μL

10×Loading

Buffer

混合后加入點(diǎn)樣孔進(jìn)行電泳，電壓

V，電流

A，電泳

30

min。用凝膠