分子克隆技術(shù)步驟

DNA片段的辦法。常含有目的基因，用體外重組辦法將它們插入克DNA的許多拷貝，從而獲得目的基因的擴增。DNAcDNA克隆兩類。cDNAmRNADNA(cDNA)DNA分子連接引入寄cDNAmRNA的構(gòu)造，cDNAmRNA的分布。特點是：①RNADNAcDNA②cDNAcDNAcDNAmRNA的③cDNA能在細菌中體現(xiàn)。cDNA僅代表某一發(fā)育階段體現(xiàn)出來的遺傳信息，只有基因文庫才包含一種生物辦法合成對應(yīng)的基因片段；④mRNAcDNA。DNA的選擇①質(zhì)粒：質(zhì)粒是細菌染色體外遺傳因子，DNA1-200千堿基對(kb)DNA片段，合用于構(gòu)建原核生物基因文庫，cDNA庫和次級克隆。DNA兩端。中間是非必需區(qū)，進行改造后組建一系列含有不同特點的載體分子。λcDNA庫。DNADNA次序分析、定點突變和核酸雜交。③拷斯(Cos)DNADNA分子。是噬菌體－質(zhì)?；旌衔?。這類45kbDNADNA，直接轉(zhuǎn)化寄主菌。DNADNADNADNA片段末端加上一段人工合成的、含有某一限制性內(nèi)切酶識別位點的寡核苷酸片段，經(jīng)限制性內(nèi)切DNA1∶1。引入寄主細胞：慣用兩種辦法：①DNADNA(M13)與氯化鈣解DNA被吸取后鋪在平板培養(yǎng)基上，再根據(jù)實驗設(shè)計使用選擇性培養(yǎng)基篩DNADNA分子無轉(zhuǎn)化能力，并且重組后的DNA分子比原載體DNA分子大，轉(zhuǎn)化困難。②轉(zhuǎn)導(dǎo)，病毒類侵染宿主菌的過程稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)，克隆的選擇λDNA片段后②DNA插入到抗藥基因區(qū)后，基因失AB藥培養(yǎng)上生長的便是重組分子。③DNA次序的克隆。辦法是將菌落或噬菌斑“印跡”到硝酸纖維膜等支持70年代才發(fā)展起來的，它的出現(xiàn)和應(yīng)用開辟了分子遺傳學(xué)研究的新領(lǐng)域，打開了人類理解、SV40病毒引發(fā)的小鼠腫瘤分子克隆——（1）DNA獲得（2）DNA（3）DNA轉(zhuǎn)化和重組克隆的篩選（4）特定重組克隆的帶有目的基因的DNADNA。重組DNA重組DNA分離制備待克隆的DNA————將靶DNA————重組DNADNA因片段；④mRNAcDNA。DNADNA片段，合用于構(gòu)建原核生物基因文庫，cDNA庫和次級克隆。DNA兩端。中間是非必需區(qū)，進行改造后組建一系列含有不同特點的載體分子。λcDNA庫。DNADNA次序分析、定點突變和核酸雜交。③拷斯(Cos)DNADNA分子。是噬菌體－質(zhì)?；旌衔铩?5kbDNADNA，直接轉(zhuǎn)化寄DNADNADNA連接酶作用下連接起來，但連接效率不如粘性末端高；③④DNA片段末端加上一段人工合成的、含有某一限制性內(nèi)切酶識別位點的DNADNAλCosDNA分子，DNA1∶1。①DNADNA(M13)與氯化鈣解決過的宿主細胞混合置于冰上，DNA被吸取后鋪在平板培養(yǎng)基上，再根據(jù)實驗設(shè)計使用選擇性培養(yǎng)基篩選重組子，普通重組分子的轉(zhuǎn)化DNADNADNA分子比原DNA分子大，轉(zhuǎn)化困難。②λDNA片②DNA插入到抗藥基因區(qū)后，基BAB藥培養(yǎng)上生長的便是重組分子。③DNA次序的克隆。辦法是將菌落或噬菌斑“印跡”到硝酸纖維膜等分子克隆技術(shù)(DNADNA插入片段的制備、連接反映以及重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化分子克?。∕olecularCloning）是指由一種祖先分子復(fù)制生成的和祖先分子完全相似的分子群，發(fā)生在基因水平上的分子克隆稱基因克?。―NA克隆。（一）DNA（二）DNA12、DNA聚合酶鏈式反映（三）（四）DNADNA克?。–lone）是指通過無性繁殖過程所產(chǎn)生的與親代完全相似的子代群體。分子克?。∕olecularCloning）（DNA克隆。其基本原理是：將編碼某一多肽或蛋白質(zhì)的基因（外源基因）組裝到細菌質(zhì)粒（DNA分子）中，再將這種質(zhì)粒（重組質(zhì)粒）轉(zhuǎn)入大腸桿菌體內(nèi)，這樣重組質(zhì)粒就隨大（一）DNADNA分子，它能賦予細菌（宿主細胞）某些特定的遺，R，1-2次）和松弛型（10-200次。由于質(zhì)粒的不相容性細菌經(jīng)分裂后就只留下了拷DNA時，首先應(yīng)將含有質(zhì)粒的細菌在含有對應(yīng)抗生素的液體培養(yǎng)基中生DNADNA。（二）DNADNADNA插入片段是分子1、mRNADNA鏈(cDNA)的過程，在逆轉(zhuǎn)錄反映中所用的是逆轉(zhuǎn)RNADNA5′-3′DNA聚合酶活性，在合成新的核苷酸鏈時也需要引cDNAmRNAmRNAmRNApoly(A)12-18cDNA。2、DNA聚合酶鏈式反映PCRDNA4種脫氧核糖核酸存在下，DNA聚合酶催化的一種體外酶促反映。PCR技DNA結(jié)合的特異性。1、變性DNA雙螺旋的氫鍵斷裂DNA2、退火DNADNA在局部形成雜交雙鏈DNA25-30DNA片段得到大量復(fù)制，2×107-8拷貝。1、GC比值：眾所周知,GC之間有三條氫鍵，AT之間有兩條氫鍵，GCAT在引物序列中的合PCRGCAT各半即可。215-20bp股模板DNA序列互相補。DNA（三）1DNADNADNADNA分子的末端產(chǎn)生相似的粘10×酶緩沖液1/10DNA1/10容量（DNA1-10單位）總?cè)萘浚―NA10-100μl。DNADNADNA連接起來構(gòu)成重組質(zhì)粒的過程。普通按下10×酶緩沖液1/10DNADNA1/10容量(DNA1-10單位)總?cè)萘浚―NA10-20μl。14-16℃6-12小時。[注意DNADNA3倍DNA（四）ADAA（如大腸桿菌（哺乳動物細胞及昆蟲細胞。原核細胞即可作為基因復(fù)制擴增的場合，也可作為基因體現(xiàn)的場合；真核細胞普通用作基因體現(xiàn)系統(tǒng)。（transformation（transfection1DNA分子，但當將大腸桿菌用物理或化學(xué)辦法解決后，細胞對攝取外來DNADNA分子的細胞叫