生物化學(xué)-第二章 蛋白質(zhì)化學(xué)-蛋白質(zhì)化學(xué)1-2

第一章蛋白質(zhì)化學(xué)第一節(jié)：概論第二節(jié)：氨基酸第三節(jié)：蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)及測(cè)序第四節(jié)：蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)第五節(jié)：蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系第六節(jié)：蛋白質(zhì)的性質(zhì)第七節(jié)：蛋白質(zhì)的別離與純化1/17/20241教學(xué)大綱了解：了解三四級(jí)結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)的功能和分類(lèi)；蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及其與功能的關(guān)系；掌握：蛋白質(zhì)根本的組成單位—氨基酸的分類(lèi)、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)；掌握蛋白質(zhì)的一、二級(jí)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)與別離純化的方法；蛋白質(zhì)測(cè)序方法重點(diǎn)、難點(diǎn)：氨基酸的分類(lèi)、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)；蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、加蛋白質(zhì)測(cè)序方法1/17/20242第一節(jié)蛋白質(zhì)概述蛋白質(zhì)生物學(xué)功能蛋白質(zhì)元素組成蛋白質(zhì)的水解1/17/20243蛋白質(zhì)的定義

蛋白質(zhì)：是一切生物體中普遍存在的，由天然氨基酸通過(guò)肽鍵連接而成的生物大分子；其種類(lèi)繁多，各具有一定的相對(duì)分子質(zhì)量，復(fù)雜的分子結(jié)構(gòu)和特定的生物功能；是表達(dá)生物遺傳性狀的一類(lèi)主要物質(zhì)。1/17/20244一、蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能蛋白質(zhì)〔protein〕是生活細(xì)胞內(nèi)含量最豐富、功能最復(fù)雜的生物大分子，并參與了幾乎所有的生命活動(dòng)和生命過(guò)程。因此，研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能始終是生命科學(xué)最根本的命題。生物體最主要的特征是生命活動(dòng)，而蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的表達(dá)者，具有以下主要功能：1.催化功能，2.結(jié)構(gòu)功能，3.運(yùn)輸和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能4.貯存功能，5.運(yùn)動(dòng)功能,6.調(diào)節(jié)功能，7.保護(hù)和防御功能,8.信息傳遞與識(shí)別功能，9特殊功能1/17/20245蛋白質(zhì)主要元素組成：C、H、O、N、S及P、Fe、Cu、Zn、Mo、I、Se等微量元素。蛋白質(zhì)平均含N量為16％,這是凱氏定氮法測(cè)蛋白質(zhì)含量的理論依據(jù)：

蛋白質(zhì)含量＝蛋白質(zhì)含N量×6.25這些元素在蛋白質(zhì)中的組成百分比約為：碳50％氫7％氧23％氮16%硫0—3％其他微量除了上法外，還有紫外比色法，雙縮脲法，F(xiàn)olin—酚,考馬斯亮蘭G—250比色法〔條件：蛋白質(zhì)必須是可溶的〕測(cè)定蛋白質(zhì)含量.1/17/20246蛋白質(zhì)是生物體內(nèi)必不可少的重要成分

(結(jié)構(gòu)功能)蛋白質(zhì)占干重人體中〔中年人〕人體45%水55%細(xì)菌50%~80%蛋白質(zhì)19%真菌14%~52%脂肪19%酵母菌14%~50%糖類(lèi)＜1%白地菌50%無(wú)機(jī)鹽7%1/17/20247第二節(jié)：氨基酸一、氨基酸的結(jié)構(gòu)與分類(lèi)二、氨基酸的性質(zhì)1/17/20248一、蛋白質(zhì)的水解

蛋白質(zhì)完全水解得到各種氨基酸的混合物，局部水解通常得到多肽片段。最后得到各種氨基酸的混合物。所以，氨基酸是蛋白質(zhì)的根本結(jié)構(gòu)單元。大多數(shù)的蛋白質(zhì)都是由20種氨基酸組成。這20種氨基酸被稱為根本氨基酸。思考

1/17/202491/17/202410〔一〕根本結(jié)構(gòu)：L－α－氨基酸結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1.都是L－α-氨基酸〔除脯氨酸外〕2.R側(cè)鏈不同3.天然氨基酸都是L-構(gòu)型的，〔與標(biāo)準(zhǔn)甘油醛的構(gòu)型參照得出的〕。1/17/202411α-氨基酸的通式(1)

1/17/202412α-氨基酸的通式(2)COO-Rgroup氨基aH=GlycineCH3=AlanineHN3+HJuangRH(2004)BCbasics1/17/202413〔二〕氨基酸的分類(lèi)根據(jù)是否構(gòu)成蛋白質(zhì)可分為蛋白質(zhì)AA和非蛋白質(zhì)AA1.常見(jiàn)的蛋白質(zhì)(組成蛋白質(zhì))氨基酸有(20種)2.不常見(jiàn)蛋白質(zhì)氨基酸3.非蛋白質(zhì)氨基酸1/17/202414A.根據(jù)側(cè)鏈的極性分為2大類(lèi)非極性R基氨基酸8種極性R基氨基酸12種極性R基不帶電荷的7種極性R基帶電荷的5種1/17/202415根據(jù)側(cè)鏈的極性分為2大類(lèi):1,非極性R基團(tuán)氨基酸1/17/202416不帶電荷極性R基團(tuán)氨基酸1/17/202417帶電荷R基團(tuán)氨基酸1/17/2024181/17/202419甘氨酸〔Gly,G〕丙氨酸〔Ala,A〕纈氨酸〔Val,V〕亮氨酸〔Lue,L〕異亮氨酸〔Ile,I〕根據(jù)側(cè)鏈的化學(xué)結(jié)構(gòu)分為3大類(lèi)：1脂肪族氨基酸

1.1，中性脂肪族氨基酸1.2,含羥基或硫脂肪族氨基酸絲氨酸〔Ser,S〕蘇氨酸〔Thr,T〕半胱氨酸〔Cys,C〕甲硫氨酸〔Met,M〕1/17/202420天冬氨酸（Asp,D）谷氨酸（Glu,E）天冬酰胺（Asn,N）谷氨酰胺（Gln,Q）1/17/2024211.4，堿性氨基酸賴氨酸〔Lys,K〕精氨酸〔Arg,R〕組氨酸（His,H）雜環(huán)1/17/2024222,芳香族氨基酸苯丙氨酸〔Phe,F〕酪氨酸〔Tyr,Y〕色氨酸〔Trg,W〕1/17/2024233,雜環(huán)氨基酸組氨酸〔His,H〕脯氨酸〔Pro,P〕1/17/202424C.根據(jù)側(cè)鏈〔R基〕酸堿性分為3大類(lèi)酸性氨基酸2種堿性氨基酸3種中性氨基酸15種1/17/2024251/17/202426二十種常見(jiàn)蛋白質(zhì)氨基酸的分類(lèi)、結(jié)構(gòu)及三字符號(hào)據(jù)營(yíng)養(yǎng)學(xué)分類(lèi)

必需ＡＡ非必需ＡＡ據(jù)R基團(tuán)化學(xué)結(jié)構(gòu)分類(lèi)

脂肪族ＡA〔中性、含羥基或硫、酸性、堿性〕芳香族ＡA(Phe、Tyr、Trp)雜環(huán)ＡＡ(His、Pro)據(jù)R基團(tuán)極性分類(lèi)極性R基團(tuán)AA非極性R基團(tuán)AA〔８種〕不帶電荷〔７種〕帶電荷：正電荷〔３種〕負(fù)電荷〔２種〕據(jù)氨基、羧基數(shù)分類(lèi)一氨基一羧基ＡＡ一氨基二羧基ＡＡ(Glu、Asp)二氨基一羧基ＡＡ(Lys、His、Arg)

人的必需氨基酸:LysTrpPheValMetLeuIleThr嬰兒時(shí)期所需：Arg、His早產(chǎn)兒所需：Try、Cys1/17/202427不常見(jiàn)蛋白質(zhì)氨基酸1/17/202428非蛋白質(zhì)氨基酸1/17/2024291/17/202430二、氨基酸的性質(zhì)物理性質(zhì)化學(xué)性質(zhì)酸堿性質(zhì)1/17/202431Why?1/17/202432〔一〕物理性質(zhì)1.溶解性：多為白色晶體，除胱氨酸和Tyr外，一般都溶于水，不溶或微溶于醇(Pro和ProoH能溶于乙醇或乙醚中)不溶于丙酮，稀酸和稀堿中溶解性好。氨基酸的熔點(diǎn)一般都比較高，一般都大于200℃2.旋光性：除甘氨酸外的氨基酸均有旋光性。3.光譜性質(zhì)：含苯環(huán)氨基酸(色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe))大π鍵有很強(qiáng)的紫外吸收。Tyr:275nm;Phe:257nm;Trp280nm蛋白質(zhì)的最大光吸收在280nm1/17/202433Trp,Tyr,Phe的

紫外吸收光譜

酪氨酸的max＝275nm，275=1.4x103;苯丙氨酸的max＝257nm，257=2.0x102;色氨酸的max＝280nm，280=5.6x103;1/17/202434〔二〕酸堿性質(zhì)氨基酸的兩性電離及等電點(diǎn)：

1/17/202435氨基酸的等電點(diǎn)〔isoelectricpointPI〕可以定義為：氨基酸所帶正負(fù)電荷相等,在電場(chǎng)中既不向陽(yáng)極也不向陰極移動(dòng)時(shí)的溶液pH。pH=pI

凈電荷=0pH<pI凈電荷為正pH>pI凈電荷為負(fù)1/17/202436左圖是甘氨酸的電離酸堿滴定曲線，第一個(gè)拐點(diǎn):pK’1:羧基解離50%的狀態(tài)，第二個(gè)拐點(diǎn):等電點(diǎn)，第三個(gè)拐點(diǎn)pK’2:氨基解離50%的狀態(tài)。

BA1/17/202437中性氨基酸：PI＝中性氨基酸PI=(pK1+pK2)/2BA1/17/202438酸性氨基酸：

pI=(pK’1

+pK’2)/2加電離圖酸性氨基酸pI=(pK1

+pK2)/21/17/202439堿性氨基酸pI=(pK’2

+pK’3)/21/17/202440

氨基酸等電點(diǎn)的計(jì)算

可見(jiàn)，氨基酸的pI值等于該氨基酸的兩性離子狀態(tài)兩側(cè)的基團(tuán)(主要)pK′值之和的二分之一。pI=2pK′1+pK′2一氨基一羧基AA的等電點(diǎn)計(jì)算：pI=2pK′2+pK′3二氨基一羧基AA的等電點(diǎn)計(jì)算：pI=2pK′1+pK′2一氨基二羧基AA的等電點(diǎn)計(jì)算：1/17/2024411.α-氨基參加的反響2.α-羧基參加的反響3.側(cè)鏈參加的反響4.α-氨基與α-羧基共同參加的反響〔三〕化學(xué)性質(zhì)1/17/202442(1)與亞硝酸反響：(2)與甲醛的反響：1.α-氨基參加的反響：(3)與2,4-二硝基氟苯〔2,4-DNFB〕的反響〔Sanger反響〕：(4)與苯異硫氰酸酯〔PITC〕反響〔Edman反響〕：(5)與丹磺酰氯〔DNS-Cl〕的反響：(7)形成Schiff堿1/17/202443(1)與亞硝酸反響：此法也是VanSlyke法測(cè)氨基氮的理論根底。該反響也用來(lái)判斷蛋白質(zhì)的水解程度。N2一半來(lái)自氨基酸除α-NH3外，ε-NH3亦可以發(fā)生反響，但速度不如α-NH3快，前者3-4min即可完成1/17/202444(2)與甲醛的反響：〔主要是因?yàn)闆](méi)有適宜的指示劑。封閉氨基后使氨基酸的滴定范圍變小，易于判斷滴定終點(diǎn)。〕此法可以作為氨基酸含量測(cè)定的依據(jù)1/17/202445(3)與2,4-二硝基氟苯〔2,4-DNFB〕的反響〔Sanger反響〕：DNP-氨基酸為黃色，它溶于乙酸乙酯；可用之抽提并與標(biāo)準(zhǔn)的DNP-氨基酸作比較。

ε-NH3、酚羥基也可以有此反響，但反響慢，且生成的DNP-氨基酸不溶于乙酸乙酯，而是保存在水相里。1/17/202446別離過(guò)程：這些衍生物是無(wú)色的，酸性條件下極穩(wěn)定，可溶于乙酸乙酯，經(jīng)高壓液相即可分析出其N(xiāo)端的氨基酸組成。(4)與苯異硫氰酸酯〔PITC〕反響〔Edman反響〕：生成的肽鏈比原來(lái)少一個(gè)氨基酸，可以進(jìn)行下一輪反響，而不需要徹底水解掉，此法是自動(dòng)氨基酸分析儀的根本原理1/17/202447酸水解生成的DNS－氨基酸〔具有熒光〕，用乙酸乙酯抽提，可得到DNS－氨基酸，用色譜法分析之，亦可不用別離，直接用紙電泳或薄層層析法鑒定用DNS(二甲基萘磺酰氯)測(cè)定N端氨基酸原理與DNFB法相同，但水解后的DNS氨基酸不需別離，可直接用電泳或?qū)游龇ㄨb定，由于DNS有強(qiáng)烈熒光，靈敏度比DNFB法高100倍，比Edman法高幾到十幾倍。可用于微量氨基酸的定量，用Edman降解法提供逐次減少一個(gè)殘基的肽鏈，靈敏度提高，能連續(xù)測(cè)定。多肽順序自動(dòng)分析儀，樣品最低用量可在5pmol。(5)與丹磺酰氯〔DNS-Cl〕的反響：Edman降解法的改進(jìn)方法1/17/2024481ng即可測(cè)出。激發(fā)波長(zhǎng)：390nm，發(fā)射波長(zhǎng)475nm可以用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行定量檢測(cè)1/17/202449(7)形成Schiff堿1/17/2024501/17/202451（1）成鹽反應(yīng)R—CH—COOH+HClNH2R—CH—COOHNH2·HCl（2）成酯反應(yīng)R—CH—COOH+C2H5OHNH2R—CH—COOC2H5NH2HCl氣1/17/202452（3）酰氯化反應(yīng)Y—NH—CRH—COOH+PCl5?；被醂—NH—CRH—COCl酰化氨基酰氯使氨基酸的羧基活化，易于另一氨基酸的氨基結(jié)合，在合成肽的工作上常用。（4）脫羧反應(yīng)H2N—CHR—COOH脫羧酶CO2+RCH2NH2胺1/17/202453試劑顏色反應(yīng)有關(guān)基團(tuán)有此反應(yīng)的氨基酸米倫反應(yīng)HgNO3Hg(NO3)2及HNO3混合物紅色

Tyr黃色反應(yīng)濃HNO3及NH3黃色、橘色

Tyr、Phe乙醛酸反應(yīng)(Hopking-Cole反應(yīng))