生豬重要疫病樣品采集要求與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)意義

生豬重要疫病樣品采集要求

與實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)意義李峰研究員山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院山東省生豬創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)濱州綜合試驗(yàn)站分享內(nèi)容實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的重要意義實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的主要內(nèi)容生豬主要疫病樣品采集要求與本卷須知其他樣品采集要求實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的重要意義明確所發(fā)生的疾病種類：傳染性因素：細(xì)菌、病毒、支原體、其它微生物；非傳染性因素單純感染/混合感染是否為人獸共患病病原分子生物學(xué)檢測(cè)分析區(qū)域優(yōu)勢(shì)毒株基因型分析病原分子進(jìn)化與演變病原分子序列與疫苗比對(duì)細(xì)菌的染色↓形態(tài)學(xué)觀察↓培養(yǎng)基的制備↓細(xì)菌別離培養(yǎng)↓純化↓細(xì)菌的生化試驗(yàn)↓藥物敏感試驗(yàn)病豬的剖檢病豬病料的采集、保存總RNA的提取↓反轉(zhuǎn)錄↓聚合酶鏈?zhǔn)椒错憽睵CR〕豬瘟病毒抗體豬偽狂犬病病毒gPI抗體(野毒)豬流感血凝抑制試驗(yàn)豬細(xì)小病毒病乳膠凝集試驗(yàn)〔LAT〕豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體↓DNA提取↓PCR血清學(xué)檢測(cè)分子診斷細(xì)菌別離↓結(jié)果分析生豬主要疫病樣品采集要求采樣原那么1、適時(shí)采集：盡可能采集到新鮮樣品。用于別離病原體的，須在病初發(fā)熱期或出現(xiàn)典型臨診病癥時(shí)采集；假設(shè)制備血清，空腹時(shí)采血。尸體上采樣，應(yīng)在動(dòng)物死后立即采集。2、典型采樣：樣品具有代表性。選擇典型動(dòng)物，即未經(jīng)藥物治療、病狀典型的動(dòng)物；選擇典型材料，病原體含量最高的材料；尸體采樣，采集有病變組織、器官或病變最明顯、最典型的部位。3、合理采樣：群體發(fā)病時(shí)，至少采5頭動(dòng)物的病料。每一種樣品應(yīng)有足夠的數(shù)量。4、無菌采樣：無菌操作，尤其是供微生物學(xué)檢查和血清學(xué)檢查的樣品5、平安采樣：注意人員平安，防止感染，防止病原擴(kuò)散造成環(huán)境污染。病理剖檢腹部朝上平放切開四肢頸部淋巴結(jié)股內(nèi)那么淋巴結(jié)剖檢頜、頸部皮下組織、頜下淋巴結(jié)觀察橫切胸骨柄，暴露胸腹腔觀察胸腹腔器官變化縱切胸骨柄取出胸腔器官剖開顱腔暴露腦部器官癥狀/病變疑似疾病體表耳尖、屁股、腹部發(fā)紫微循環(huán)障礙：豬瘟、弓形體背部發(fā)紫，規(guī)則菱形，邊緣整體豬丹毒全身通紅鏈球菌鼻子流血和/泡沫胸膜肺炎背部點(diǎn)狀出血、毛孔出血、皮膚發(fā)白附紅細(xì)胞體、藍(lán)耳病會(huì)陰、臀部、四肢出現(xiàn)周邊紫色，中間白色圓形、邊緣紫褐色紐扣狀壞死圓環(huán)病毒依據(jù)剖檢病變推導(dǎo)可能發(fā)生疫病淋巴結(jié)頜下淋巴結(jié)腫大，出血性壞死全身淋巴結(jié)有大理石樣出血變化腹股溝淺淋巴結(jié)水腫、切口外翻，表面蒼白，滲出透明液體咽、頸及腸系膜淋巴結(jié)黃白色干酪樣壞死灶淋巴結(jié)充血、水腫、小點(diǎn)狀出血

支氣管淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)髓樣腫脹豬炭疽、鏈球菌病豬瘟、藍(lán)耳、豬肺疫圓環(huán)病毒2型豬結(jié)核急性豬肺疫、豬丹毒、鏈球菌病豬氣喘病、豬肺疫、傳染性胸膜肺炎、副傷寒血液血液黑或發(fā)紫，不凝固中毒，內(nèi)源性毒素：弓形體、胸膜肺炎、鏈球菌、豬丹毒血液不凝固、稀薄貧血，藍(lán)耳、附紅細(xì)胞體呼吸道喉頭出血豬瘟扁桃體化膿、出血豬瘟、偽狂犬喉頭有泡沫藍(lán)耳、副豬、傳胸氣管有很多粘液細(xì)菌性疾病肺出血斑點(diǎn)纖維素性肺炎心葉、尖葉、中間葉肝樣變水腫，小點(diǎn)狀壞死粟粒性、干酪樣結(jié)節(jié)表面零星、邊界清楚、濕潤(rùn)肉樣變豬瘟豬肺疫、傳染性胸膜肺炎氣喘病弓形體病結(jié)核病流感心臟心包積液心包炎、心外膜炎（絨毛心）心外膜斑點(diǎn)狀出血心肌條紋狀壞死帶心內(nèi)膜出血心瓣膜呈菜花樣心肌內(nèi)有米粒大灰白色包囊泡副豬、傳胸副豬、傳胸、氣喘病豬瘟、豬肺疫、鏈球菌病口蹄疫敗血癥鏈球菌、慢性豬丹毒豬囊尾蚴病肝淤血腫大沙門氏菌表面灰白色或灰黃色纖維素沙門氏菌病、副豬、大腸桿菌白色壞死點(diǎn)，彌漫性壞死沙門氏菌、偽狂犬、霉菌毒素、中毒脂肪肝傳染性胃腸炎、流行性腹瀉、仔豬大腸桿菌膽囊腫大、膽汁粘稠沙門氏菌膽囊腫大，膽汁呈黃色泥狀圓環(huán)病毒脾脾邊緣有鋸齒狀出血、梗死彌漫性出血淤血腫大，壞死脾邊緣有小點(diǎn)狀出血豬瘟、仔豬副傷寒豬瘟、豬丹毒、弓形體、豬肺疫弓形體病，霉菌毒素中毒（全）仔豬紅痢胃胃粘膜斑點(diǎn)狀出血，潰瘍胃粘膜充血、卡他性炎癥，呈大紅布樣/麥麩狀假膜粘膜下水腫胃壁增厚豬瘟、胃潰瘍豬丹毒、食物中毒副傷寒水腫病水腫、大腸桿菌、魏氏梭菌腸乳糜管內(nèi)無脂肪、出血病毒性腹瀉乳糜管內(nèi)有脂肪細(xì)菌、球蟲或營(yíng)養(yǎng)性腹瀉腸壁有白色綠豆大肉芽腫、淋巴濾泡增生沙門氏菌、食道線蟲（大腸）、球蟲（結(jié)腸、盲腸）漿膜出血豬瘟回盲瓣出血、壞死，盲腸扣狀腫豬瘟腸粘膜出血流感、梭菌性腸炎、增生性腸炎腎蒼白，針尖狀出血豬瘟、偽狂犬淤血、腫大豬丹毒、梭菌、鏈球菌（紫紅色、紅棕色）；藍(lán)耳（紫黑色）；增生性腸炎（灰黑色，腎乳頭淡黑色）灰白色、表面隆突不平圓環(huán)病毒膀胱粘膜層有出血斑點(diǎn)豬瘟睪丸1個(gè)或2個(gè)睪丸腫大、發(fā)炎、壞死或萎縮乙型腦炎、布氏桿菌病關(guān)節(jié)腫大、積液副豬、鏈球菌依據(jù)病種確定主要采集病料病名病原主要臨床癥狀特征病理變化主要病料采集實(shí)驗(yàn)室診斷豬瘟HCV體溫41℃左右，膿性結(jié)膜炎，皮膚紅斑點(diǎn)，指壓不退色，先便秘后腹瀉，公豬包皮囊積尿，小豬多有神經(jīng)癥狀。實(shí)質(zhì)器官多發(fā)性出血性為特征的敗血癥病變，腎臟有出血點(diǎn)或斑，尿道、膀胱、喉頭均有出血點(diǎn)，脾臟邊緣梗死。扁桃體、淋巴結(jié)、脾臟、腎臟和血清接種PK15細(xì)胞、分離病毒；ELISA、RT-PCR、GIA檢測(cè)病原豬繁殖與呼吸障礙綜合征（藍(lán)耳?。㏄RRSV母豬流產(chǎn)，早產(chǎn)，死胎，木乃伊胎。胎兒大小比較一致，少數(shù)病豬雙耳、尾部等發(fā)生短暫性皮膚紫紺。哺乳仔豬呈結(jié)膜炎，呼吸障礙及流鼻涕。青年豬見呼吸道癥狀。間質(zhì)性肺炎；肺水腫；淋巴結(jié)腫大呈褐色。病豬的肺、流產(chǎn)胎兒的腸和腹水、母豬血清、鼻拭子、糞便、扁桃體、脾、淋巴結(jié)接種Marc-145細(xì)胞分離鑒定；ELISA方法檢測(cè)抗體；分子生物學(xué)RT-PCR病名病原主要臨床癥狀特征病理變化主要病料采集實(shí)驗(yàn)室診斷豬偽狂犬病PRV引起懷孕母豬流產(chǎn)，以死胎為主。仔豬也可出現(xiàn)體溫升高，呼吸困難，下痢和特征性神經(jīng)癥狀，15日齡以內(nèi)仔豬易感，病死率可達(dá)100%。木乃伊胎或死胎重吸收。扁桃體白色潰瘍或壞死灶，肝臟表面白色壞死點(diǎn)，脾臟白色壞死灶。腦部水腫等。扁桃體、脊髓、淋巴結(jié)、腦組織動(dòng)物試驗(yàn)；接種vero細(xì)胞分離病毒；PCR檢測(cè)病原。豬圓環(huán)病毒病PCV2被毛粗亂，喜擠堆，精神沉郁，呼吸急促，皮膚蒼白，腹瀉，消瘦。淋巴結(jié)異常腫大、切面為白色。脾臟腫大，腎臟腫大呈土黃色，并有散在的紅色壞死斑點(diǎn)，肺臟質(zhì)地較硬似橡皮。肺臟、淋巴結(jié)、腎臟分子生物學(xué)PCR病名病原主要臨床癥狀特征病理變化主要病料采集實(shí)驗(yàn)室診斷流行性腹瀉PEDV水樣腹瀉，或者在腹瀉之間有嘔吐。嘔吐多發(fā)生于吃食或吃奶后。一周齡內(nèi)新生仔豬發(fā)生腹瀉后3—4天，呈現(xiàn)嚴(yán)重脫水而死亡，死亡率可達(dá)50%，最高的死亡率達(dá)100%。小腸擴(kuò)張，內(nèi)充滿黃色液體，腸系膜充血，腸系膜淋巴結(jié)水腫。糞便、腸內(nèi)容物接種Vero細(xì)胞，分離病原，RT-PCR檢測(cè)。傳染性胃腸炎TGEV一般2周齡以內(nèi)的仔豬感染后12-24小時(shí)會(huì)出現(xiàn)嘔吐，繼而出現(xiàn)嚴(yán)重的水樣或糊狀腹瀉，糞便呈黃色，常夾有未消化的凝乳塊，惡臭，仔豬明顯脫水，發(fā)病2-7天死亡，死亡率達(dá)100%；在2-3周齡的仔豬，死亡率在0-10%。主要病變?cè)谖负托∧c，呈現(xiàn)充血、出血并含有未消化的小凝乳塊，腸壁變薄。腸、腸內(nèi)容物接種PK15細(xì)胞分離病毒，分子生物學(xué)RT-PCR病名病原主要臨床癥狀特征病理變化主要病料采集實(shí)驗(yàn)室診斷口蹄疫FMDV豬口腔粘膜、鼻吻部、蹄部以及乳房皮膚發(fā)生水皰和潰爛為特征。不同年齡的豬易感程度不完全相同，一般是越年幼的仔豬發(fā)病率越高，病情越重，死亡率越高。仔豬心肌炎。水泡皮、水泡液、心臟、血清ELISA檢測(cè)抗體豬流感SIV發(fā)病初期病豬體溫突然升高至40.3～41.5℃，厭食或食欲廢絕，極度虛弱，常臥地。呼吸急促、腹式呼吸、陣發(fā)性咳嗽。從眼和鼻流出粘液，鼻分泌物有時(shí)帶血。病豬擠臥在一起，難以移動(dòng)，觸摸肌肉僵硬、疼痛，打嗝。剖檢可見喉、氣管充滿含有氣泡的黏液，黏膜充血，肺間質(zhì)增寬，淋巴結(jié)腫大、充血，脾腫大，胃腸黏膜有卡他出血性炎癥，胸腹腔、心包積液。肺、脾、淋巴結(jié)、血清、鼻拭子接種vero細(xì)胞、雞胚分離病毒，分子生物學(xué)RT-PCR供病原學(xué)檢查材料的采集、處理1、血液。前腔靜脈或耳靜脈采血。2、分泌物和滲出液：采集口腔、鼻腔、喉氣管、泄殖腔和陰道分泌物時(shí)，通常是將棉棒插入天然孔反復(fù)旋轉(zhuǎn)后蘸上分泌物，然后將樣品端剪下。3、淋巴結(jié)、內(nèi)臟器官、肌肉：淋巴結(jié)連帶周圍脂肪整體采集；內(nèi)臟器官和肌肉，通常取病變最明顯的部位。4、水皰皮：將病變部位清水清洗，剪取新鮮水皰皮3－5g放入滅菌小瓶?jī)?nèi)5、腸管：選取至少6cm腸管，兩端結(jié)扎，從結(jié)扎線外端稍遠(yuǎn)端剪斷。以上病料采集后，立即放入滅菌的玻璃容器，密封，外貼標(biāo)簽。做細(xì)菌學(xué)檢查的，盡快冷藏。做病毒學(xué)檢查的，盡快冷凍或參加病毒保護(hù)液。常用的病毒保護(hù)液：含抗生素的磷酸鹽緩沖液、50%甘油磷酸鹽緩沖液。供血清學(xué)檢查材料的采集、處理〔1〕采血。用于制備血清的血液采出后不加抗凝劑，不進(jìn)行脫纖處理。大中動(dòng)物每頭不少于5ml?！?〕制備血清。采血時(shí)使血液直接流入試管，加塞，立即擺成斜面，待血液凝固后豎起試管，使血清自然析出。也可將血液離心別離血清。作血清學(xué)檢測(cè)的血液，在采集、運(yùn)送、制備血清過程中，均應(yīng)防止震動(dòng)和凍結(jié)，防止溶血，影響檢測(cè)結(jié)果?！?〕血清保存。制備的血清假設(shè)能在一周內(nèi)檢測(cè)，4℃冷藏，假設(shè)需保存較長(zhǎng)時(shí)間，應(yīng)于－30℃凍結(jié)。豬的前腔靜脈采血方法豬只的固定。公母豬用保定繩固定，要求盡可能吊得高一點(diǎn)，使豬的頭頸與水平面呈30度以上角度(如圖1)，這樣，即方便采血人員觀察采血部位，又使前腔靜脈向外突出，靜脈血充脹。20kg以上的中大豬，由1-2個(gè)飼養(yǎng)員用捉豬器(或保定繩)拉住，頭昂起，偏向右側(cè)(如圖2、3)；20kg以下的小豬，可由1-2個(gè)飼養(yǎng)員抓起，倒立，后背緊靠在欄架上(如圖4)。圖1公母豬保定圖2中豬固定和采血圖3大豬固定和采血圖4小豬的保定與采血選取適宜的針筒和針頭。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，公母豬宜選用16#50mm針頭(這種針頭豬場(chǎng)不常用，但很多針頭生產(chǎn)廠家都有生產(chǎn)，可以找獸醫(yī)藥械銷售店聯(lián)系購置)；30kg以上的中大豬，宜選用12#38mm針頭；10-30kg小豬，可選用9#25mm(一次性注射器常配的針頭)；10kg以下乳豬，應(yīng)選擇9#20mm針頭(一次性注射器所配的另一種規(guī)格的針頭)找準(zhǔn)下針部位。豬的前腔靜脈，越往頭部越淺，但也越細(xì)；越靠胸部越粗，但越深。所以，采血應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)牟课弧Ｐ∝i取血的部位太靠前，血管太小，很難扎中，而且扎中了也很難抽到血液，所以，小豬的采血部位應(yīng)稍靠后。中大豬和公母豬血管比較大，往后太深，針頭夠不到血管，所以，應(yīng)略靠前。根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，20kg以下的小豬應(yīng)采兩前肢與氣管交匯處(如圖4)，公母豬和20kg以上中大豬可選頸部最低凹處(如圖2、3〕。下針和抽血。小豬：對(duì)準(zhǔn)以上描述的部位，用針垂直刺入。拉緊針筒活塞，假設(shè)針頭扎中前腔靜脈，可見到血液自血管源源流出，抽取所需的血量即可。公母豬和中大豬：對(duì)準(zhǔn)下針部位，使針頭偏向氣管約15o方向下針，拉緊針筒活塞，假設(shè)扎中，可見血液流出。如果見不至血液流出，說明沒有扎中，有可能是前腔靜脈較深，可用手頂緊針筒，使針頭扎深一點(diǎn)。處理好