醫(yī)學遺傳學課件：基因診斷的技術

基因診斷的技術

基因診斷的技術（一）核酸分子雜交探針（probe）：一段與目的基因或DNA片段互補的特異的單鏈核苷酸序列示圖ASO探針斑點雜交示圖（等位基因特異性寡核苷酸）Southern(DNA)印記雜交:示圖16-3①限制酶酶切DNA②電泳分離③堿變性④Southern印跡轉(zhuǎn)移⑤與標記探針雜交⑥放射自顯影ASO探針斑點雜交PKU,AR正常探針突變探針臨床遺傳學（二）聚合酶鏈式反應（PCR）PCR、實時熒光定量PCR（三）DNA芯片技術大規(guī)模集成的固相點雜交多種探針固定于芯片（四）熒光原位雜交(FISH)（五）比較基因組雜交患者和正常人基因組DNA探針兩重熒光強度比值（六）多重探針連接擴增（MLPA）多重探針雜交、連接及PCR擴增（七）單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）純合型正常2條帶與純合型突變2條帶位置不同，雜合型突變有4條帶。示圖變性高效液相色譜（DHPLC）雜合型突變的擴增產(chǎn)物變性再復性，形成2種異源雜合雙鏈和2種同源純合雙鏈，2種異源雜合雙鏈（部分錯誤配對）較2種同源純合雙鏈（全部正確配對）更容易變性，先從色譜柱上被洗脫，故呈現(xiàn)早些4個單鏈峰和晚些4個單鏈峰。純合型正常2個單鏈峰與純合型突變2個單鏈峰不同。高分辨率溶解曲線HRM雜合型突變的擴增產(chǎn)物變性再復性，形成2種異源雜合雙鏈和2種同源純合雙鏈，4種分子復性速度不同。NNNMMM（八）DNA測序第一代測序雙脫氧測序法第二代測序高通量基因組測序第三代測序單分子實時測序（九）甲基化檢測甲基化特異性PCR(MSP)、亞硫酸氫鈉處理后測序（BSP）（十）反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和Northern印跡雜交三、直接基因診斷的實例（一）杜氏肌營養(yǎng)不良(DMD)XRDMD基因79個外顯子60%大片段缺失或重復，其余小片段結(jié)構(gòu)異?；螯c突變?nèi)笔停憾嘀豍CR圖然后Gap-PCRMLPA針對每個外顯子設計探針，同時進行檢測。其余型：PCR擴增外顯子后測序RT-PCR間接基因診斷見前述（二）鐮狀細胞貧血GAG→GTG示圖16-8PCR-RFLP，即先PCR再MstII酶切擴增片段。也可不經(jīng)PCR直接MstII酶切全基因組，用βA、βS探針，行Southern印記雜交。PCR-ASO示圖16-9（三）β654地中海貧血突變在內(nèi)含子中增加剪接位點從而增加一個外顯子RT-PCR（四）血友病AXRFVⅢ基因主要點突變或小片段堿基的缺失和插入，基因突變位點多。間接基因診斷見前述（五）脆性X綜合征FMR1基因（CGG）nn正常5-50，前突變59-200（未甲基化），全突變200-1000（甲基化）示圖16-12雙酶切（EcoRI和甲基化敏感酶EagI）Southern印跡雜交五、遺傳病診斷的時機臨床診斷早期診斷（癥狀前診斷、產(chǎn)前診斷、著床前診斷）六、產(chǎn)前診斷遺傳學檢查、生化檢查、物理診