第一章 生物反應(yīng)器

學(xué)習(xí)方式老師課堂講授同學(xué)們分組、分專題討論期末考試小組討論作業(yè)考勤生物工程下游技術(shù)我國開展生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)，迫切需要兩方面人才：從事實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的“上游學(xué)術(shù)人才〞，能幫助提升中國的生物科技水平；熟悉科技成果產(chǎn)業(yè)化操作的“下游工程人才〞，能及時(shí)將科技成果產(chǎn)業(yè)化。重要原因之一：企業(yè)管理、市場營銷以及金融投資方面的人才大多不懂生物技術(shù)，同時(shí)專業(yè)的生物技術(shù)人才又不懂市場開發(fā)?！吧嫌伍_發(fā)〞僅比國際水平落后3—5年，而“下游工程〞卻至少相差15年以上。中國生物技術(shù)與興旺國家的差距之一：研究與市場脫節(jié)第一講生物反響器課時(shí)：2節(jié)課主要內(nèi)容：生物工程下游技術(shù)課程的簡介〔理解〕生物反響器的一些概念〔掌握〕生物反響器的根本類型〔掌握〕細(xì)胞生長及代謝過程動力學(xué)〔了解〕生物反響器的設(shè)計(jì)〔難點(diǎn)〕生物工程專業(yè)知識體系上游基因工程：從基因之分子層次，開發(fā)生物系統(tǒng)菌種分離、鑒定保存與育種技術(shù)蛋白質(zhì)工程：蛋白質(zhì)分析、結(jié)構(gòu)、功能、合成等，

以及從分子層次改變酶及蛋白質(zhì)之特性中游細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程：動植物細(xì)胞及微生物培養(yǎng)技術(shù)

發(fā)酵工程：發(fā)酵最適化、發(fā)酵控制微生物工程：菌種、培養(yǎng)基、發(fā)酵工藝、雜菌下游酶工程：酶催化性質(zhì)、酶固定化和修飾、新酶開發(fā)等生物反應(yīng)器：設(shè)計(jì)、自動化免疫應(yīng)用技術(shù)：抗原、抗體生物分離技術(shù):產(chǎn)品回收、純化、制備、放大、試產(chǎn)生產(chǎn)。生化檢測分析技術(shù)生物工程下游技術(shù)概念狹義：專指生物物質(zhì)產(chǎn)品的別離純化技術(shù)。主要包括細(xì)胞破碎、固液別離、膜別離、層析技術(shù)、電泳技術(shù)等。廣義：生物反響器、生物物質(zhì)別離、產(chǎn)品分析檢測及質(zhì)量監(jiān)控。目前尚無明確概念何謂生物反響過程？廣義上一切動植物、微生物的生長繁殖都可以看作是生物反響過程。狹義上指那些能夠應(yīng)用于生物工業(yè)中的過程。生物反響過程原料的預(yù)處理及培養(yǎng)基的制備生物催化劑的制備

生物反響器及反響條件的選擇。

產(chǎn)品的別離與純化

上游加工過程中游加工過程下游加工過程細(xì)胞或酶等生物催化劑〔游離或固定化〕生物反應(yīng)器空氣CO2等冷卻水原材料培養(yǎng)基滅菌底物產(chǎn)物廢物除菌檢測和控制產(chǎn)物預(yù)處理產(chǎn)品提取或液化副產(chǎn)物一般生化反響過程過程分類酶促反應(yīng)過程微生物反應(yīng)過程動植物細(xì)胞反應(yīng)過程廢水生物處理過程反應(yīng)水平分子水平細(xì)胞水平細(xì)胞水平群體水平反應(yīng)復(fù)雜性簡單較復(fù)雜復(fù)雜很復(fù)雜底物、產(chǎn)物數(shù)量較少較多較多很多反應(yīng)速度較快較快較慢很慢生物反響過程的分類生物反響過程的特點(diǎn)：⑴常溫下進(jìn)行，操作條件溫和，勿需防爆。原料以碳水化合物為主，不含有毒物質(zhì)。⑵以生命體的自動調(diào)節(jié)方式進(jìn)行，多個(gè)反響像一個(gè)反響一樣，可在單一設(shè)備中進(jìn)行。⑶容易進(jìn)行復(fù)雜的高分子化合物生產(chǎn)，如酶、光學(xué)活性體等。⑷能高度選擇性地進(jìn)行復(fù)雜化合物在特定部位的反響，如氧化、復(fù)原、官能團(tuán)的導(dǎo)入等⑸生產(chǎn)產(chǎn)品的生物體本身也是產(chǎn)物，富含維生素、蛋白質(zhì)、酶等。⑹生產(chǎn)過程中需要注意防止雜菌污染，尤其是噬菌體的侵入，以免造成很大的危害。⑺通過改進(jìn)生物體生產(chǎn)性能，可在不增加設(shè)備投資的條件下，利用原有的生產(chǎn)設(shè)備使生產(chǎn)能力飛躍上升。第一節(jié)根本概念一、生物反響器:利用酶或生物體〔如微生物、動植物細(xì)胞〕所具有的特殊功能，在體外進(jìn)行生物化學(xué)反響的裝置系統(tǒng)。如實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)生產(chǎn)中用于細(xì)胞培養(yǎng)的裝置〔方瓶、錐形瓶、發(fā)酵裝置、瓊脂斜面〕。

作用：為細(xì)胞代謝提供一個(gè)優(yōu)化的物理化學(xué)環(huán)境,使細(xì)胞更快更好地生長,得到更多的需要的生物量或代謝產(chǎn)物。生物反響器與化學(xué)反響器的區(qū)別化學(xué)反響器：從原料進(jìn)入到產(chǎn)物生成，需要加壓和加熱；高能耗過程。生物反響器：有酶和微生物的參與，常溫和常壓下進(jìn)行化學(xué)合成；生物〔酶除外〕反響都以“自催化〞方式進(jìn)行。超大發(fā)酵罐：高100米，直徑7米，容積為4000立方米，猶如一座壯觀的圓形塔。生物反響器首先在發(fā)酵工業(yè)中得到應(yīng)用〔發(fā)酵罐〕。另一種是以固定化酶或固定化細(xì)胞為催化劑的酶反響器。生物反響器的應(yīng)用★

Foodadditives

★

Antibodies★

ProteinDrugs★

Healthfood

★

Naturalspice

★

Animalfeedadditives

★

Industrialenzyme

★

Cosmeticsmaterial

銜接實(shí)驗(yàn)室技術(shù)與工廠實(shí)際生長的橋梁使用高效率生物反響器的目的:提高產(chǎn)品的生成速率減少輔助設(shè)備降低生產(chǎn)本錢獲得最大的經(jīng)濟(jì)效益編輯ppt二、研究生物反響器的目的〔內(nèi)容〕確定為到達(dá)一定的生產(chǎn)目的需要多大的生物反響器，什么樣的結(jié)構(gòu)更好；〔設(shè)計(jì)〕對已有的生物反響器進(jìn)行分析，到達(dá)優(yōu)化的目的；〔優(yōu)化〕分析各種生物反響器的數(shù)據(jù)，從而對細(xì)胞的生長、代謝等過程有更深入的理解。第二節(jié)生物反響器的根本類型一、根據(jù)培養(yǎng)對象的不同：微生物培養(yǎng)反響器動植物細(xì)胞培養(yǎng)反響器二、按操作方式：批式培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)半連續(xù)培養(yǎng)〔一〕微生物培養(yǎng)反響器殼體控溫局部攪拌局部通氣局部進(jìn)料口量測系統(tǒng)附屬系統(tǒng)根本通氣方式:浸沒式鼓泡器,外表通氣裝置,膜反響器二種常見的微生物發(fā)酵裝置：常規(guī)發(fā)酵罐(機(jī)械攪拌式),氣體提升式發(fā)酵罐形式最簡單的反響器:沒有機(jī)械攪拌和通氣系統(tǒng)的反響罐機(jī)械攪拌裝置1、機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐具有機(jī)械攪拌及壓縮空氣分布裝置的發(fā)酵罐，目前最大的通用式發(fā)酵罐容積約為480m3。罐的混合——機(jī)械攪拌，促使培養(yǎng)基混合均勻，有利于增加氣液接觸面積，提高溶氧速率。對于雙液相反響體系可提高液-液接觸面積，另外還可促進(jìn)傳熱與固形物料的懸浮?！睵11圖1－8〕常規(guī)〔機(jī)械〕發(fā)酵罐是促使微生物生長的一種反響設(shè)備，廣泛應(yīng)用于制藥、化工、食品等行業(yè)。日本味之素發(fā)酵罐：500M3

周口味精廠發(fā)酵罐：200M3

益力味精廠發(fā)酵罐：630M3

臺灣味丹發(fā)酵罐：660M3李錦記（新會）食品有限公司包裝生產(chǎn)線李錦記（新會）食品有限公司醬油發(fā)酵罐2、氣升式反響器特點(diǎn)：無機(jī)械攪拌,減少了剪切作用對細(xì)胞傷害。易于清洗、維修，不易染菌，能耗低，溶氧效率高。氣體從罐下部通入，借氣體的升力帶動流體在整個(gè)反響器內(nèi)循環(huán)流動造成良好的混合。見P11圖1-9。目前已廣泛應(yīng)用于生物工程領(lǐng)域的好氧發(fā)酵方面，由此生產(chǎn)的產(chǎn)品有單細(xì)胞蛋白、酒精、抗生素、生物外表活性劑等。以甲醇為原料生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白高密度培養(yǎng)時(shí)混合不夠均勻河南蓮花味精集團(tuán)公司使用的氣升式發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)用氣升式玻璃發(fā)酵罐〔實(shí)物〕氣升式反響器種子罐(實(shí)物)某抗菌素制藥車間的一級種子罐和二級種子罐右邊為300L一級種子罐，左邊為3000L二級種子罐10L臺式發(fā)酵罐從人孔向發(fā)酵罐內(nèi)鳥瞰圖〔二〕動植物細(xì)胞培養(yǎng)反響器與微生物培養(yǎng)根本一樣；動植物細(xì)胞比較嬌嫩，有貼壁生長需要，對培養(yǎng)要求高，因而在選用及設(shè)計(jì)時(shí)要特別考慮：防止或減低機(jī)械攪拌產(chǎn)生的剪切力；氣泡外表張力可對細(xì)胞造成傷害，通氣時(shí)要防止氣泡與細(xì)胞接觸；進(jìn)行pH調(diào)節(jié)或補(bǔ)料時(shí)要嚴(yán)格防止化學(xué)環(huán)境急劇變化對細(xì)胞的傷害；載體選擇尤其重要。機(jī)械攪拌式生物反響器連續(xù)攪拌釜式反響器干擾素生產(chǎn)用動物細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備高效內(nèi)循環(huán)生物反響器〔HCR〕新疆紫草細(xì)胞培養(yǎng)流程細(xì)胞在培養(yǎng)周期中的變化丹參發(fā)根生物反響器大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)丹參(Salviamiltiorrhiza)：活血化淤,通經(jīng)止痛。丹參有效成分在原植物根中含量低、生長周期長。藥用植物發(fā)根大規(guī)模培養(yǎng)的關(guān)鍵在于其生物反響器培養(yǎng)技術(shù)。發(fā)根培養(yǎng)已在攪拌、氣升、噴淋床、霧化等形式的生物反響器中進(jìn)行。南陽天冠酒精集團(tuán)公司中央兩個(gè)酒精發(fā)酵罐小型和大型生物反響器設(shè)計(jì)的不同點(diǎn)工程實(shí)驗(yàn)用小型反響器生產(chǎn)用反響器功率消耗不必考慮需認(rèn)真對待反響器內(nèi)空間因大量的控制、無此影響檢測裝置占去一定空間混合特性可不必考慮需認(rèn)真對待換熱系統(tǒng)較易解決較難解決中空纖維管式動物細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)反響器中空纖維作為通氣裝置：空氣在管內(nèi)，氧分子通過半透性的管壁溶透到培養(yǎng)液中，供給動物細(xì)胞生長。培養(yǎng)液中不會產(chǎn)生氣泡，可防止損傷動物細(xì)胞。假設(shè)在中空纖維管束中通入純氧，那么傳遞能力還可以提高。培養(yǎng)液通過下層螺旋槳攪拌器緩慢攪動循環(huán)，微載體在培養(yǎng)液中保持懸浮狀態(tài)。工業(yè)用生物反響器機(jī)械攪拌式反響器氣舉式反響器固定化酵素細(xì)胞反響器流動床生物反響器膜反響器攪拌式發(fā)酵槽填充床反響器：裝填有固體催化劑或固體反響物用以實(shí)現(xiàn)多相反響過程的一種反響器。固體物通常呈顆粒狀，粒徑2～15mm左右,堆積成一定高度〔或厚度〕的床層。床層靜止不動，流體通過床層進(jìn)行反響。它與流化床反響器的區(qū)別在于固體顆粒處于靜止?fàn)顟B(tài)。固定床反響器主要用于實(shí)現(xiàn)氣固相催化反響，如氨合成塔、二氧化硫接觸氧化器、烴類蒸汽轉(zhuǎn)化爐等。底物產(chǎn)物底物產(chǎn)物流化床反響器二、生物反響器按操作方式分：批式培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)半連續(xù)培養(yǎng)1、批式反響器：營養(yǎng)物與菌種一次參加進(jìn)行培養(yǎng)，直到結(jié)束放出，中間除了空氣進(jìn)入和尾氣排出，與外部沒有物料交換。以機(jī)械攪拌式和氣升式為最多?！踩鐚?shí)驗(yàn)室搖瓶培養(yǎng)〕優(yōu)點(diǎn)：操作簡單。缺點(diǎn)：細(xì)胞所處化學(xué)環(huán)境在培養(yǎng)過程中明顯改變，營養(yǎng)物質(zhì)在培養(yǎng)過程分布不合理；初期細(xì)胞濃度低增長慢，后期雖細(xì)胞濃度升高，但營養(yǎng)物濃度低而使生長不快?？偟脑O(shè)備生產(chǎn)效率不高。2、連續(xù)培養(yǎng)反響器：不斷地往反響器中參加營養(yǎng)物，利用罐中的菌體增殖得到產(chǎn)物，并不斷采出。在良好的控制下，罐內(nèi)菌體的增殖速度可以與采出速度相同而到達(dá)穩(wěn)態(tài)。分為二類：恒化器連續(xù)培養(yǎng)：通過控制培養(yǎng)基中某種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度根本恒定的方式，保持細(xì)菌的比生長速率恒定，使生長“不斷〞進(jìn)行。恒濁器連續(xù)培養(yǎng)：通過光電系統(tǒng)控制培養(yǎng)液中菌體濃度恒定、使細(xì)菌生長連續(xù)進(jìn)行。3、半連續(xù)反響器：介于批式和連續(xù)培養(yǎng)之間，分二種方式：補(bǔ)料批式或流加過程：在批式培養(yǎng)過程中不斷補(bǔ)入營養(yǎng)物，近年來常用，可解決營養(yǎng)物抑制及缺乏問題，提高設(shè)備效率；在補(bǔ)料的同時(shí)間斷采出一定量的發(fā)酵液體產(chǎn)物，延長發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間。優(yōu)缺點(diǎn)：連續(xù)和半連續(xù)培養(yǎng)有利于過程的優(yōu)化及效率提高，但易污染，要嚴(yán)格控制。一、生物過程動力學(xué)：定量地描述過程的速率以及影響過程速率的諸多因素，包括細(xì)胞生長速率、各種基質(zhì)消耗的速率、代謝產(chǎn)物的生成速率。第二節(jié)細(xì)胞生長及代謝過程動力學(xué)反響速率：單位時(shí)間物質(zhì)濃度的變化量。細(xì)胞生長速率為dx/dt，代謝產(chǎn)物生成速率為dp/dt，基質(zhì)消耗速率為ds/dt。比速率：單位濃度菌體在一定條件下引起的反響速率。表示為μ=dx/x.dt、qs=-ds/xdt、qp=dp/xdt。得率系數(shù)：兩種物質(zhì)得失之間的計(jì)量比。Yx/s，Yp/s。

二、細(xì)胞濃度：單位體積培養(yǎng)液中所含細(xì)胞的量(mol/L)或菌體的干重，表示為kg/m3。只有相對于均衡生長模型的細(xì)胞培養(yǎng)體系才可用細(xì)胞濃度這一表示方式。測量方法：直接測定法：細(xì)胞干重法、顯微計(jì)數(shù)法、平板計(jì)數(shù)法、濁度法。間接測量法：測定細(xì)胞成分，如大分子物質(zhì)細(xì)胞群體的描述模型：非結(jié)構(gòu)模型〔最理想情況〕：細(xì)胞群體視為一種溶質(zhì)結(jié)構(gòu)模型：細(xì)胞之間無差異；細(xì)胞內(nèi)有多個(gè)組分離散模型：不考慮細(xì)胞結(jié)構(gòu)；各種細(xì)胞不均一實(shí)際情況：細(xì)胞之間不均一；細(xì)胞內(nèi)部多組分均衡生長平均細(xì)胞均衡生長平均細(xì)胞均衡生長模型：不考慮細(xì)胞內(nèi)部的結(jié)構(gòu)，又不考慮細(xì)胞之間的任何差異；三、細(xì)胞均衡生長的動力學(xué)模型細(xì)胞生長模型；基質(zhì)消耗模型；產(chǎn)物生成動力學(xué)模型。1、細(xì)胞生長模型(只用生物量或細(xì)胞濃度來描述細(xì)胞的量〕細(xì)胞生長動力曲線:延遲期、指數(shù)生長期、〔減速生長期〕、靜止期、自溶期〔衰亡期〕。細(xì)胞生長動力學(xué)描述：〔數(shù)學(xué)模型〕比生長速率〔重要參數(shù)〕：μ=dx/xdt〔單位體積內(nèi)單位量細(xì)胞經(jīng)過單位時(shí)間增加的細(xì)胞量〕μ反映了菌體增長的能力，受菌株及各種物理化學(xué)環(huán)境的影響，μ與限制性底物濃度的關(guān)系定量表達(dá)為Monod方程：其中μm為最大比生長速率；Ks為Monod常數(shù)〔飽和系數(shù)〕，取決于環(huán)境條件〔pH,溫度，離子強(qiáng)度等〕；根本上反映了比生長速率與底物濃度的關(guān)系，由Ks值又反映了比生長速率與環(huán)境的關(guān)系。不適于較黏稠的發(fā)酵液(另有模型〕。有二個(gè)以上限制性底物;有抑制性底物或抑制性產(chǎn)物存在時(shí)有不同的模型表示.2、基質(zhì)消耗模型：基質(zhì)包括：碳源、氮源、氧及其他營養(yǎng)源基質(zhì)消耗包括：細(xì)胞生長〔合成新細(xì)胞〕、細(xì)胞維持生命、合成次級代謝產(chǎn)物。數(shù)學(xué)模型〔P6：式1-9〕式中右邊各項(xiàng)依次表示菌體生長、維持及次級代謝所消耗基質(zhì)的速率。3、產(chǎn)物生成動力學(xué)模型產(chǎn)物：主要指細(xì)胞培養(yǎng)過程中代謝生成的除細(xì)胞量外的產(chǎn)品；數(shù)學(xué)模型：dp/dt=α(dx/dt)+βx其中α、β是與生長及菌體有關(guān)的比例系數(shù)，與菌株及各種環(huán)境因素有關(guān)。第三節(jié)生物反響器的設(shè)計(jì)生物反響器設(shè)計(jì)的重要方面：改善生物催化劑更好的進(jìn)行過程控制有更好的無菌條件能克服速度限制因素〔特別是熱量和質(zhì)量傳遞〕等。一、微生物反響器設(shè)計(jì)的根本要求〔8點(diǎn)〕〔1〕防止將需蒸汽滅菌的部件與其它部件連接，因?yàn)榧词归y門關(guān)閉，細(xì)菌也可在閥門內(nèi)生長；〔2〕盡量減少法蘭連接，如有可能，應(yīng)采用全部焊接結(jié)構(gòu)，焊接部位一定要確實(shí)磨光，以消除積蓄耐滅菌的固體物質(zhì)的場所；〔3〕防止死角、裂縫等情況，以防止固體物質(zhì)在此堆積，形成使雜菌獲得熱抗性的環(huán)境〔4〕發(fā)酵系統(tǒng)的某些局部應(yīng)能單獨(dú)滅菌；〔5〕與反響器相通的任何連接都應(yīng)采用蒸氣加以密封，如取樣口在不取樣時(shí)也要一直通蒸氣；〔6〕所有閥門要易清洗、易使用、易滅菌，比較好的閥們有球閥、隔膜閥和截止閥等；〔7〕反響器應(yīng)始終保持正壓以排除滲漏；〔8〕為了便于清洗，反響器主體應(yīng)盡量簡單。

二、生物反響器選型與設(shè)計(jì)的要點(diǎn)1、選擇適宜的生物催化劑。包括了解產(chǎn)物在生物反應(yīng)的哪一階段大量生成、適宜的pH和溫度，是否好氧和易受雜菌污染等。2、確定適宜的反應(yīng)器形式。3、確定反應(yīng)器規(guī)模、幾何尺寸、操作變量等。4、傳熱面積的計(jì)算。5、通風(fēng)與攪拌裝置的設(shè)計(jì)計(jì)算。6、材料的選擇與確保無菌操作的設(shè)計(jì)。7、檢驗(yàn)與控制裝置。8、安全性。9、經(jīng)濟(jì)性。

培養(yǎng)的細(xì)胞類型及其生長特性(動力學(xué)特性)目的產(chǎn)物是什么,其物化性質(zhì)及其對別離的影響基質(zhì)的成分及物理化學(xué)性質(zhì)期望的年產(chǎn)量反響器類型溫度范圍pH范圍需要溶氧量基質(zhì)濃度產(chǎn)物別離方式?jīng)Q定了供氧、勻質(zhì)、產(chǎn)物別離、抑制物去除三、生物反響器設(shè)計(jì)所要考慮的主要問題四、生物反響器設(shè)計(jì)的根本方法根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)推論最正確方案;根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)動力學(xué)模型推論最正確方案;二者結(jié)合并互相驗(yàn)證五、生物反響器的放大比較放大：根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和數(shù)學(xué)模型，利用近似法那么和因次分析等手段，將實(shí)驗(yàn)室的小型設(shè)備獲得的較高產(chǎn)量效率在大型生產(chǎn)設(shè)備里重現(xiàn)的方法。要解決的主要問題：氣態(tài)氧向液相中傳遞的速率受到限制；營養(yǎng)物質(zhì)不能及時(shí)保持均勻從而導(dǎo)致菌體生長的限制。1.氧的供給氧的供給常常成為菌體生長的限制因素深層培養(yǎng)中氧的供給是液體中溶解的氧，必須由氣泡傳給發(fā)酵液，其傳遞速率為：OTR=kLa(C*-C),其中KLa為傳氧系數(shù)發(fā)酵反響器設(shè)計(jì)要求有盡量高的傳氧系數(shù)傳氧系數(shù)的測量有：直接測量法、動態(tài)法、亞硫酸鹽氧化法2.罐內(nèi)流體的混合罐內(nèi)流體的混合：一方面是為了加強(qiáng)氧的傳遞，另一方面使流體混合均勻，防止局部過濃或過稀并強(qiáng)化菌體與營養(yǎng)物的接觸。解決方法攪拌的設(shè)計(jì)及控制：優(yōu)化反響器尺寸、操作條件等各方面以利于氧的傳遞和溶質(zhì)的均勻具體方法：增加攪拌速率；增大通氣量；通入純氧；放出局部絲狀體；添加少量水不溶性的比水有更高溶氧度的另一相，如十二烷生物反響器放大的一般原那么幾何相似原那么；恒定等體積功率放大；恒定傳氧系數(shù)放大；恒