0402 細(xì)胞培養(yǎng)用液

Chapter4AnimalCellCulture◆Biologyofcellsinculture◆Fluidforcellculture◆Standardcellculturetechniques◆Establishingacelllineorcellstrain◆Cellfreezingandrecovery◆AnimalCellEngineering◆Section2：細(xì)胞培養(yǎng)用液水和平衡鹽溶液天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基無(wú)血清培養(yǎng)基其它常用液培養(yǎng)基的配制一、水和平衡鹽溶液1.蒸餾水玻璃蒸餾器制備的三次蒸餾水盡量減少開啟次數(shù)存放時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，一般不要超過(guò)2周最好現(xiàn)制現(xiàn)用2.平衡鹽溶液〔balancedsaltsolution,BSS〕主要是由無(wú)機(jī)鹽、葡萄糖組成，它的作用是維持細(xì)胞滲透壓平衡，保持pH穩(wěn)定及提供簡(jiǎn)單的營(yíng)養(yǎng)。主要用于取材時(shí)組織塊的漂洗、細(xì)胞的漂洗、配制其他試劑等。Ringer、PBS、HanksorD-Hanks〔無(wú)鈣、鎂離子〕配制離散細(xì)胞的消化液和洗滌液時(shí)，宜用鈣、鎂離子含量低的或無(wú)鈣、鎂離子的溶液可配制成10×濃度的貯存液，用時(shí)稀釋高壓滅菌，冰箱保存渾濁或沉淀時(shí)，應(yīng)重新配制成效：①維持滲透壓；②提供緩沖系統(tǒng)；③提供水分和無(wú)機(jī)鹽要求：①和培養(yǎng)物來(lái)源的動(dòng)物血清相似；②等滲如：平衡鹽溶液：無(wú)Ca2+、Mg2+的緩沖液

PBS：NaCl8.0gKCl0.2gNa2HPO4.H2O1.56gKH2PO40.20

加新鮮配置的三蒸水或去離子水水至1000ml二、天然培養(yǎng)基培養(yǎng)基〔培養(yǎng)液〕是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。蛙胚延髓組織培養(yǎng)在青蛙淋巴凝塊內(nèi)天然培養(yǎng)基血清：提供營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)因子，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，粘附及中和有毒物質(zhì)血漿：支持培養(yǎng)組織塊及供給細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，現(xiàn)在不常用組織浸出液：可用雞胚胎浸出液，含大分子核蛋白質(zhì)和小分子氨基酸，能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)水解乳蛋白：氨基酸含量高，由乳白蛋白質(zhì)經(jīng)水解得到淡黃色粉末，一般可配制成0.5%溶液。血清中的主要成分：①多種蛋白質(zhì)〔白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等〕②多種金屬離子③激素④促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等⑤各種生長(zhǎng)因子⑥其它不明成分優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)：來(lái)源受限。成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染三、人工合成培養(yǎng)基●

常用種類：RPMI1640；DMEM；MEM；Eagle；199等合成培養(yǎng)液的成分氨基酸幾乎所有細(xì)胞在缺少谷氨酰胺時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)不良而死亡。谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應(yīng)置－20度保存，用前參加培養(yǎng)液內(nèi)。含谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4度貯存2周以上時(shí)，應(yīng)重新參加谷氨酰胺碳水化合物維生素?zé)o機(jī)離子其他培養(yǎng)時(shí)要加血清！四、無(wú)血清培養(yǎng)基無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基的使用保證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，減少了細(xì)胞污染，簡(jiǎn)化了提純和鑒定各種細(xì)胞產(chǎn)物的程序。1975年，Sato首次成功地用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體細(xì)胞株，近20多年來(lái)已報(bào)道了幾十種細(xì)胞系在無(wú)血清培養(yǎng)基中成功地生長(zhǎng)和增殖。無(wú)血清培養(yǎng)基的主要研制策略：在根底培養(yǎng)基中補(bǔ)充各種必需因子，如激素、生長(zhǎng)因子、結(jié)合蛋白、貼壁和擴(kuò)展因子等。無(wú)血清培養(yǎng)基的組成根底培養(yǎng)液替代血清的附加成分〔細(xì)胞外基質(zhì)、激素、生長(zhǎng)因子等〕向無(wú)清培養(yǎng)液中能促進(jìn)細(xì)胞系生長(zhǎng)的補(bǔ)加物都是獨(dú)特的。適用于某種細(xì)胞株的培養(yǎng)液，很可能不適合另一種細(xì)胞株的生長(zhǎng)。即使同源組織的不同細(xì)胞株，所需補(bǔ)加物也不同。無(wú)血清培養(yǎng)基尚處于研究階段。目前，大多數(shù)人工合成培養(yǎng)基使用時(shí)還需添加血清。五、其它常用液★消化液

胰蛋白酶溶液

EDTA溶液★pH調(diào)整液

NaHCO3液

HEPES液★抗生素液★消化液〔可含0.02%EDTA〕胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細(xì)胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細(xì)胞骨架，從而使細(xì)胞別離。胰蛋白酶液濃度越高，作用越強(qiáng)，但超過(guò)一定限度會(huì)損傷細(xì)胞。胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無(wú)Ca2+、Mg2+的D-Hanks或PBS緩沖液配制；常用的胰蛋白酶液濃度是0.25％。用濾器過(guò)濾除菌。胰蛋白酶液消化時(shí)間：2-10分鐘。用含血清培養(yǎng)液終止其對(duì)細(xì)胞的消化作用★0.02%EDTA溶液亦稱Versen液。化學(xué)鰲合劑，對(duì)細(xì)胞有一定的離解作用。EDTA：乙二胺四乙酸二鈉★pH調(diào)整液NaHCO3液：常用濃度7.4%、5.6%、3.7%。三蒸水配制，過(guò)濾除菌，塞緊瓶塞保存。NaHCO3+H2O→Na++HCO3-+H2O→Na＋＋H2CO3＋OH-→Na++OH-+H2O+CO2↑HEPES〔N’-2-hydroxy-ethylpiperazine-N’-ethanesulfonicacid〕液：一種氫離子緩沖劑，可較長(zhǎng)時(shí)間保持緩沖作用?？砂此铦舛取惨话?0～50mM〕直接參加配制的培養(yǎng)液中。HEPES是一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸〔MW=238.31〕，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性HEPES不是起維持pH恒定的作用，而是起恒定和抵抗快速pH變化的，所以調(diào)整pH常常用NaHCO3溶液?！锟股匾涸谂囵B(yǎng)液配制后，培養(yǎng)液內(nèi)常加適量抗菌素，以抑制由于操作不慎所致的微生物污染。通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用。培養(yǎng)基內(nèi)最終使用濃度為青霉素100單位/ml、鏈霉素100微克/ml〔雙抗〕?？筛鶕?jù)不同的污染物選擇抗生素：如，制霉菌素一般配制成母液，用時(shí)稀釋！〔除菌？〕計(jì)算：100ml培養(yǎng)基加50ulPS，母液濃度應(yīng)配成多少？P每瓶80萬(wàn)U，可配〔〕ml母液？相應(yīng)參加〔〕克S？六、培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)液的種類生長(zhǎng)培養(yǎng)液根本培養(yǎng)基80%-90%血清10%-20%抗生素〔青霉素100單位/ml和鏈霉素100μg/ml〕維持液根本培養(yǎng)基95%-98%血清2%-5%血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無(wú)沉淀物，無(wú)細(xì)菌、支原體、病毒污染。血清的滅活〔消除補(bǔ)體活性〕：56℃，30分鐘血清的消毒：過(guò)濾除菌★培養(yǎng)基的配制舉例RPMI-1640培養(yǎng)粉1袋碳酸氫鈉2.0g青、鏈霉素各100單位／毫升加三蒸水至1000ml,過(guò)濾除菌。調(diào)節(jié)pH值至7.2加血清〔終濃度10％〕

培養(yǎng)基粉末中一般都參加了酚紅〔當(dāng)溶液酸性時(shí)pH小于6.8呈黃色；當(dāng)溶液堿性時(shí)pH大于8.4呈紫紅色〕，一種pH指示劑?！锱囵B(yǎng)基的選擇培養(yǎng)成敗的