食品中植物性成分檢驗(yàn)方法-蒜成分之定性檢驗(yàn)

食品中植物性成分檢驗(yàn)方法－蒜成分之定性檢驗(yàn)1. 適用範(fàn)圍：本檢驗(yàn)方法適用於食品中蒜成分之定性檢驗(yàn)。2. 檢驗(yàn)方法：聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction，PCR）方法及即時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（real-timepolymerasechainreaction，RT-PCR）方法。2.1. 工作環(huán)境：工作平臺(tái)需寬敞、潔淨(jìng)、光線(xiàn)良好。檢體前處理、檢體DNA抽取、PCR試劑配製及PCR等實(shí)驗(yàn)過(guò)程皆需有區(qū)隔空間，避免交叉污染。PCR試劑之配製應(yīng)於無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。2.2. 裝置（註1）2.2.1. 聚合酶鏈反應(yīng)器：ABIPRISM?9700SequenceDetector，或同級(jí)品。2.2.2. 註2ABIPRISM?7700SequenceDetector或RocheLightCycler?，或同級(jí)品。2.2.3. 真空冷凍乾燥裝置：溫度可達(dá)-40℃以下，真空度可達(dá)133mBar2.2.4. 振盪型粉碎機(jī)：RetschMM200，或同級(jí)品。2.2.5. 真空乾燥裝置：供DNA乾燥用。2.2.6. 高壓滅菌釜。2.2.7. 無(wú)菌操作臺(tái)。2.2.8. 加熱振盪器：具55℃2.2.9. 微量冷凍離心機(jī)（Microrefrigeratedcentrifuge）：可達(dá)20000×g，並具4℃2.2.10. 離心機(jī)：供各式微量離心管離心用。2.2.11. 分光光度計(jì)：具波長(zhǎng)260nm、280nm。2.2.12. 冷凍設(shè)備：具冷藏及凍結(jié)功能。2.2.13. 旋渦混合器（Vortexmixer）。2.2.14. 電泳槽：供DNA電泳用。2.2.15. 照相裝置：供拍攝電泳膠片用。2.2.16. 紫外燈箱：具波長(zhǎng)302nm、365nm紫外燈。2.2.17. pH測(cè)定儀。2.2.18. 水浴裝置：溫差±1℃2.2.19. 天平：最大稱(chēng)重量為2000g，靈敏度為0.1g；最大稱(chēng)重量為100g，靈敏度為1mg。

註1： 本方法所使用或提及之產(chǎn)品品牌不代表為同類(lèi)產(chǎn)品中最好者；反之，未使用或提及之產(chǎn)品品牌亦不代表為同類(lèi)產(chǎn)品中較差者。註2： 確認(rèn)試驗(yàn)用。

2.3. 試藥2.3.1. DNA抽取用試藥：乙醇（96-100%）採(cǎi)分子生物分析級(jí)試藥；適用於植物DNA抽取之市售套組。2.3.2. PCR用（註3）2.3.2.1. 鑑別試驗(yàn)用引子2.3.2.1.1. 植物共通性基因（標(biāo)的基因：ribosomalRNA，供作內(nèi)部對(duì)照基因）引子F：5.8SF,5’-ACTCTCGGCAACGGATATCTYG-3’引子R：5.8SR,5’-GGCGCAACTTGCGTTCAAAR-3’PCR增幅產(chǎn)物大小116bp2.3.2.1.2. 蒜（標(biāo)的基因：internaltranscribedspacer，ITS）引子F：AsF,5’-CGACGAGTGCATTTTGGGTTATGATG引子R：AsR,5’-CATCGTGCGTTAACTCGACACACCAT-3’PCR增幅產(chǎn)物大小130bp2.3.2.2. 確認(rèn)試驗(yàn)用引子及探針2.3.2.2.1. 植物共通性基因（標(biāo)的基因：ribosomalRNA，供作內(nèi)部對(duì)照基因）引子F：5.8SF,5’-ACTCTCGGCAACGGATATCTYG-3’引子R：5.8SR,5’-GGCGCAACTTGCGTTCAAAR-3’探針P：5.8SP,5’-(FAM)-TCGATGGTTCRCGGGATTCTGCAATTCA-(TAMRA)-3’PCR增幅產(chǎn)物大小116bp2.3.2.2.2. 蒜（標(biāo)的基因：internaltranscribedspacer，ITS）引子F：AsF,5’-CGACGAGTGCATTTTGGGTTATGATG-3’引子R：AsR,5’-CATCGTGCGTTAACTCGACACACCAT-3’探針P：AsP,5’-(FAM)-ATGGAGAATGACCTTCCGTGCTT-(TAMRA)-3’PCR增幅產(chǎn)物大小130bp

註3：1. 合成之引子及探針，拆封後，以無(wú)菌純水稀釋成適當(dāng)濃度，分裝後置於-20℃貯存?zhèn)溆?，另探針需避光保存。探?’端採(cǎi)用6-carboxy-fluorescein（FAM）標(biāo)記，3’端採(cǎi)用6-carboxytetramethyl-rhodamine（TAMRA2. 植物共通性基因引子及探針之序列中，Y為混合鹼基代碼（C/T），表示同時(shí)含C及T；R為混合鹼基代碼（A/G），表示同時(shí)含A及G。

2.3.2.3. 去氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate，dNTP）溶液含去氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate，dATP），去氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate，dCTP），去氧鳥(niǎo)糞嘌呤苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate，dGTP）及去氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate，dTTP）各2.5mM之溶液。2.3.2.4. 聚合酶

TaqDNApolymerase（2U/μL），或同級(jí)品。2.3.2.5. TaqManUniversalPCRMasterMix（確認(rèn)試驗(yàn)用，適用於ABIPRISM?7700）

本試劑內(nèi)含RT-PCR所需去氧核糖核苷三磷酸、聚合酶等，使用時(shí)僅需自行添加引子、探針及待測(cè)檢體DNA即可。2.3.2.6. LightCycler?FastStartDNAMasterHybProbe（確認(rèn)試驗(yàn)用，適用於RocheLightCycler?）

本試劑內(nèi)含RT-PCR所需去氧核糖核苷三磷酸、聚合酶等，使用時(shí)僅需自行添加氯化鎂溶液、引子、探針及待測(cè)檢體DNA即可。2.3.3. 二甲苯藍(lán)（xylenecyanolFF）、乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraaceticaciddisodiumsalt,Na2-EDTA）、三羥甲基氨基甲烷（tris(hydroxy5methyl)aminomethane(Tris)）、甘油及硼酸，均採(cǎi)分子生物分析級(jí)試藥。DNA分子量標(biāo)記物質(zhì)（DNAmolecularweightmarker）：100-bpDNAladdermarker。2.3.4. 對(duì)照用物質(zhì)：蒜之組織，或使用行政院衛(wèi)生署藥物食品檢驗(yàn)局提供編號(hào)pIDP2之參考質(zhì)體作為對(duì)照用物質(zhì)。2.4. 器具及材料（註4）2.4.1. 吸管（Pipette）：10μL、20μL、100μL、200μL及1000μL。2.4.2. 電泳膠片製作盤(pán)。2.4.3. 吸管尖頭（Pipettetips）：10μL、20μL、200μL及1000μL。2.4.4. 離心管：200μL、600μL、1.5mL及2mL。2.4.5. PCR反應(yīng)管：200μL及500μL。2.4.6. PCR玻璃毛細(xì)管（註5）：RocheLightCycler?專(zhuān)用。2.4.7. 玻璃或塑膠瓶：50mL、100mL、250mL、500mL、1000mL及2000mL。2.4.8. 塑膠離心管：50mL。2.4.9. 過(guò)濾膜：孔徑為0.45μm，材質(zhì)為nitro-cellulose。

註4： 使用之塑膠或玻璃器皿均為無(wú)DNase污染。註5： 儀器使用RocheLightCycler?時(shí)，才需使用。

2.5. 試劑之配製2.5.1. 5倍TBE（Tris-borate-EDTA）緩衝溶液稱(chēng)取三羥甲基氨基甲烷54g、硼酸27.5g及0.5MpH8.0EDTA溶液20mL，加水溶解使成1000mL，供作5倍TBE緩衝溶液。臨用前以水稀釋為0.5倍。2.5.2. 2%膠片稱(chēng)取瓊膠2g，加入0.5倍TBE緩衝溶液100mL，加熱攪拌至瓊膠完全溶解，適當(dāng)冷卻後，倒入電泳膠片製作盤(pán)，並置入適當(dāng)之尺梳，待膠片凝固後，即可使用。2.5.3. 6倍載入膠片緩衝溶液（6×gelloadingbuffer）並置於4℃2.5.4. 膠片染液稱(chēng)取溴化乙錠0.1g，加水10mL溶解，供作原液（含溴化乙錠10mg/mL），使用前需以水稀釋成含溴化乙錠1μg/mL。溴化乙錠為致癌物質(zhì)，配製時(shí)應(yīng)注意安全。2.5.5. PCR溶液（註6）2.5.5.1. 鑑別試驗(yàn)用10倍PCR緩衝溶液（含15mM氯化鎂） 2.5μLTaqDNApolymerase（2U/μL） 1.0μL2.5mMdNTP 4.0μL10μM引子F 1.0μL10μM引子R. 1.0μL檢體DNA溶液（總量100ng） 5.0μL無(wú)菌純水 10.5μL總體積 25.0μL2.5.5.2. ABIPRISM?7700SequenceDetector確認(rèn)試驗(yàn)用5μM引子F 1.25μL5μM引子R 1.25μL3.3μM探針P 1.7μLTaqManUniversalPCRMasterMix 12.5μL檢體DNA溶液（總量100ng） 5.0μL無(wú)菌純水 3.3μL總體積 25.0μL2.5.5.3. RocheLightCycler?確認(rèn)試驗(yàn)用5μM引子F. 1.5μL5μM引子R 1.5μL3.3μM探針P 1.5μLLightCycler?FastStartDNAMasterHybProbe 2.0μL25mM氯化鎂溶液 2.4μL檢體DNA溶液（總量100ng） 5.0μL無(wú)菌純水 6.1μL總體積 20.0μL

註6： PCR溶液應(yīng)置於冰浴中配製。

2.6. 檢體DNA之製備2.6.1. 檢體之處理（註7）檢體為乾燥者，可直接以粉碎機(jī)研磨成細(xì)粉。檢體為溼狀者，經(jīng)真空冷凍乾燥處理後，再以粉碎機(jī)研磨成細(xì)粉備用。本項(xiàng)檢體之處理亦可以液態(tài)氮凍結(jié)後研磨成細(xì)粉。檢體需貯存於乾燥及冷凍環(huán)境中。

註7： 1.研磨檢體時(shí)應(yīng)於區(qū)隔之空間進(jìn)行，避免交叉污染。 2.溼狀檢體之乾燥時(shí)間可視乾燥程度調(diào)整。

2.6.2. DNA之抽取2.6.2.1. 採(cǎi)用適用於植物DNA抽取之市售套組，並依套組操作說(shuō)明步驟抽取DNA。2.6.2.2. 抽取之DNA溶液收集至已滅菌之1.5mL離心管，為檢體DNA原液。2.6.2.3. 依2.6.3.節(jié)測(cè)定DNA濃度並記錄後，置於-20℃2.6.3. DNA濃度測(cè)定及純度判斷

取適當(dāng)量之檢體DNA原液以無(wú)菌純水做適當(dāng)倍數(shù)之稀釋?zhuān)謩e測(cè)定260nm及280nm之吸光值（O.D.）。計(jì)算DNA濃度係以波長(zhǎng)260nm吸光值乘50ng/μL及稀釋倍數(shù)，即為檢體DNA原液濃度。DNA溶液純度則以O(shè).D.260/O.D.280比值作判斷，其比值應(yīng)介於1.7～2.0間。2.7. 鑑別試驗(yàn)（註8）2.7.1. PCR操作步驟以無(wú)菌純水適當(dāng)稀釋檢體DNA原液、引子備用。取PCR反應(yīng)管，並依照2.5.5.1.節(jié)配製PCR溶液，依序加入無(wú)菌純水、10倍PCR緩衝溶液、dNTP、引子、DNApolymerase及檢體DNA溶液，混合均勻後，將反應(yīng)管置於離心機(jī)瞬間離心，使混合液聚積於反應(yīng)管之底部。移入PCR反應(yīng)器，並參照2.7.2.節(jié)設(shè)定反應(yīng)條件，進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)束後，取出PCR增幅產(chǎn)物，進(jìn)行電泳分析。2.7.2 PCR條件 步驟溫度時(shí)間1. 最初變性955min2. 變性9530sec3. 黏接

測(cè)試內(nèi)部對(duì)照基因及蒜標(biāo)的基因6030sec4. 延展7230sec步驟2至步驟4，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)反應(yīng)。5. 最終延展727min

2.7.3. 膠片電泳分析取適量之6倍載入膠片緩衝溶液，分別與無(wú)菌純水（空白組）及PCR增幅產(chǎn)物混合均勻，注入2%膠片孔中，以50或100伏特電壓進(jìn)行電泳。同時(shí)，必須取DNA分子量標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行電泳，作為PCR增幅產(chǎn)物大小之判別與計(jì)算依據(jù)。經(jīng)電泳後之膠片置入膠片染液中進(jìn)行染色約15分鐘，續(xù)置入水中漂洗及褪染，再以紫外光照射觀察是否有明顯之DNA螢光帶，並判讀結(jié)果。每次實(shí)驗(yàn)必須同時(shí)測(cè)試正反應(yīng)及負(fù)反應(yīng)對(duì)照組。2.7.4. 鑑別檢體DNA需同時(shí)進(jìn)行內(nèi)部對(duì)照基因及蒜標(biāo)的基因之PCR測(cè)試。檢體DNA之PCR增幅產(chǎn)物電泳結(jié)果，須與正反應(yīng)對(duì)照組及DNA分子量標(biāo)記物質(zhì)之電泳結(jié)果進(jìn)行相互比對(duì)，當(dāng)檢體DNA與正反應(yīng)對(duì)照組DNA二者皆出現(xiàn)PCR增幅產(chǎn)物，經(jīng)由DNA分子量標(biāo)記物質(zhì)估算內(nèi)部對(duì)照基因PCR增幅產(chǎn)物大小為116bp，且蒜標(biāo)的基因PCR增幅產(chǎn)物大小為130bp者，即判定該檢體含有蒜成分。

註8：1. PCR鑑別試驗(yàn)結(jié)果之判讀係以PCR增幅產(chǎn)物大小判定，當(dāng)測(cè)試結(jié)果判讀困難時(shí)，建議進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)。

2. 檢體DNA之純度將直接影響後續(xù)PCR測(cè)試結(jié)果，檢體DNA進(jìn)行內(nèi)部對(duì)照基因PCR測(cè)試，可確定是否含有DNA及其純度。

3. 本PCR定性反應(yīng)條件係採(cǎi)ABIPRISM?9700設(shè)定之，當(dāng)使用其他機(jī)型時(shí)，應(yīng)自行探討反應(yīng)條件。

2.8. 確認(rèn)試驗(yàn)：本實(shí)驗(yàn)視需要而操作之。2.8.1. RT-PCR操作步驟2.8.1.1. RT-PCR－ABIPRISM?7700SequenceDetector以無(wú)菌純水適當(dāng)稀釋檢體DNA原液、引子及探針備用。取PCR反應(yīng)管，並依照2.5.5.2.節(jié)配製PCR溶液，依序加入TaqManUniversalPCRMasterMix、稀釋過(guò)之引子及探針，混合均勻後，分裝20μL入PCR反應(yīng)管中，再各別加入檢體DNA溶液5μL，最後將PCR反應(yīng)管置於離心機(jī)中，以200×g（1500rpm）瞬間離心，移入RT-PCR反應(yīng)器，依下列條件進(jìn)行反應(yīng)。每次實(shí)驗(yàn)皆須製作正反應(yīng)及負(fù)反應(yīng)對(duì)照組。 步驟溫度時(shí)間1. 熱活化502min2. 最初變性9510min3. 變性9515sec4. 黏接、延展

測(cè)試內(nèi)部對(duì)照基因及蒜標(biāo)的基因601min步驟3至步驟4，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)反應(yīng)。5. 冷卻3545sec

2.8.1.2. RT-PCR