限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用

限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用病毒免疫室編輯ppt限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)30多年前，當(dāng)人們?cè)趯?duì)噬菌體的宿主特異性的限制-修飾現(xiàn)象進(jìn)行研究時(shí)，首次發(fā)現(xiàn)了限制性內(nèi)切酶。細(xì)菌可以抵御新病毒的入侵，而這種“限制〞病毒生存的方法那么可歸功于細(xì)胞內(nèi)部可摧毀外源DNA的限制性內(nèi)切酶。這些酶可在特定位點(diǎn)切開(kāi)DNA，產(chǎn)生可體外連接的基因片段。研究者很快發(fā)現(xiàn)內(nèi)切酶是研究基因組成、功能及表達(dá)非常有用的工具。當(dāng)限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用在上世紀(jì)七十年代流傳開(kāi)來(lái)的時(shí)候，以NEB為代表的許多公司尋找更多的限制性內(nèi)切酶編輯ppt限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn)限制性內(nèi)切酶的形式多樣，從大小上來(lái)說(shuō)，它們可以小到如PvuII〔157個(gè)氨基酸〕，也可以比1250個(gè)氨基酸的CjeI更大除了某些病毒以外，限制性內(nèi)切酶只在原核生物中被發(fā)現(xiàn)在已純化分類的3000種限制性內(nèi)切酶中，已發(fā)現(xiàn)了超過(guò)250種的特異識(shí)別序列。編輯ppt限制性內(nèi)切酶的主要功能

保護(hù)細(xì)菌不受噬菌體的感染，這一觀點(diǎn)已被人們廣泛接受。它們作為微生物免疫機(jī)制的一局部行使其功能。當(dāng)一個(gè)沒(méi)有限制性內(nèi)切酶的細(xì)菌被病毒感染時(shí)，大局部病毒顆粒都能成功地進(jìn)行感染。然而一個(gè)有限制性內(nèi)切酶的同種細(xì)菌被成功感染的比率顯著下降。出現(xiàn)更多的限制性內(nèi)切酶將會(huì)起到多重保護(hù)作用；而一個(gè)擁有4到5種各自獨(dú)立的限制性內(nèi)切酶將會(huì)使細(xì)胞堅(jiān)不可摧。

編輯ppt限制性內(nèi)切酶常常伴隨一到兩種修飾酶〔甲基化酶〕出現(xiàn)。后者的作用是保護(hù)細(xì)胞自身的DNA不被限制性內(nèi)切酶破壞限制性內(nèi)切酶和它的"伙伴"--甲基化酶一起就構(gòu)成了限制-修飾〔R-M〕系統(tǒng)。在一些R-M系統(tǒng)中，限制性內(nèi)切酶和修飾酶是兩種不同的蛋白，它們各自獨(dú)立行使自己的功能；而在另一些系統(tǒng)中，兩種功能由同一種限制-修飾酶的不同亞基，或是同一亞基的不同結(jié)構(gòu)域來(lái)執(zhí)行編輯ppt限制性內(nèi)切酶的命名限制性內(nèi)切酶命名的次序如下：A〕用3個(gè)字母代表來(lái)源的生物〔如Bam代表Bacillusamyloliquefaciens〕B〕1個(gè)字母或阿拉伯?dāng)?shù)字代表菌株〔BamH〕C〕1個(gè)羅馬字母代表發(fā)現(xiàn)或鑒定的次序〔BamHI〕編輯ppt限制性內(nèi)切酶的分類按照亞基組成、酶切位置、識(shí)別位點(diǎn)、輔助因子等因素劃分為三大類

I型限制性內(nèi)切酶是一類兼有限制性內(nèi)切酶和修飾酶活性的多個(gè)亞基的蛋白復(fù)合體。它們?cè)谧R(shí)別位點(diǎn)很遠(yuǎn)的地方任意切割DNA鏈。盡管I型酶在生化研究中很有意義，但由于不產(chǎn)生確定的限制片段和明確的電泳條帶，因而不具備實(shí)用性。編輯ppt限制性內(nèi)切酶的分類II型酶在其識(shí)別位點(diǎn)之中或臨近確實(shí)定位點(diǎn)特異地切開(kāi)DNA鏈。它們產(chǎn)生確定的限制片段和跑膠條帶，因此是三類限制性內(nèi)切酶中唯一用于DNA分析和克隆的一類。II型限制性內(nèi)切酶由一群性狀和來(lái)源都不盡相同的蛋白組成，因而任意一種限制性內(nèi)切酶的氨基酸序列可能與另一種限制性內(nèi)切酶的氨基酸序列截然不同。實(shí)際上，從的情況上看，這些酶很可能是在進(jìn)化過(guò)程中各自獨(dú)立產(chǎn)生的，而非來(lái)源于同一個(gè)祖先。編輯ppt限制性內(nèi)切酶的分類

III型限制性內(nèi)切酶也是兼有限制-修飾兩種功能的酶。它們?cè)谧R(shí)別位點(diǎn)之外切開(kāi)DNA鏈，并且要求識(shí)別位點(diǎn)是反向重復(fù)序列；它們很少能產(chǎn)生確定的切割片段，因而不具備實(shí)用價(jià)值，也沒(méi)有人將其商業(yè)化。編輯pptII型限制性內(nèi)切酶的分類〔一〕內(nèi)切酶中最普遍的是象HhaI、HindIII和NotI這樣在識(shí)別序列中進(jìn)行切割的酶。這一類酶是構(gòu)成商業(yè)化酶的主要局部。大局部這類酶都以同二聚體的形式結(jié)合到DNA上，因而識(shí)別的是對(duì)稱序列；但有極少的酶作為單聚體結(jié)合到DNA上，識(shí)別非對(duì)稱序列。一些酶識(shí)別連續(xù)的序列〔如EcoRI識(shí)別GAATTC〕；而另一些識(shí)別不連續(xù)的序列〔如BglI識(shí)別GCCNNNNNGGC〕。限制性內(nèi)切酶的切割后產(chǎn)生一個(gè)3‘羥基端和一個(gè)5’磷酸基團(tuán)。它們的活性要求鎂離子的存在，而相應(yīng)的修飾酶那么需要S-甲硫氨酸腺苷的存在。這些酶一般都比較小，亞基一般都在200-300個(gè)氨基酸左右。編輯pptII型限制性內(nèi)切酶的分類〔二〕IIS型酶，比方FokI和AlwI，它們?cè)谧R(shí)別位點(diǎn)之外切開(kāi)DNA。這些酶的大小居中，約為400-650個(gè)氨基酸左右；它們識(shí)別連續(xù)的非對(duì)稱序列，有一個(gè)結(jié)合識(shí)別位點(diǎn)的域和一個(gè)專門切割DNA的功能域。一般認(rèn)為這些酶主要以單體的形式結(jié)合到DNA上，但與臨近的酶結(jié)合成二聚體，協(xié)同切開(kāi)DNA鏈。因此一些IIS型的酶在切割有多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)的DNA分子時(shí)，活性可能更高。編輯pptII型限制性內(nèi)切酶的分類〔三〕第三種II型限制性內(nèi)切酶〔有時(shí)也被稱為IV型限制性內(nèi)切酶〕是一類較大的、集限制和修飾功能于一體的酶，通常由850-1250個(gè)堿基組成，在同一條多肽鏈上同時(shí)具有限制和修飾酶活性。有些酶識(shí)別連續(xù)序列，并在識(shí)別位點(diǎn)的一端切開(kāi)DNA鏈；而另一些酶識(shí)別不連續(xù)的序列〔如BcgI：CGANNNNNNTGC〕，并在識(shí)別位點(diǎn)的兩端切開(kāi)DNA鏈，產(chǎn)生一小段含識(shí)別序列的片段。這些酶的氨基酸序列各不相同，但其結(jié)構(gòu)組成是一致的。他們?cè)贜端有一個(gè)負(fù)責(zé)切開(kāi)DNA的功能域，這個(gè)域又與DNA修飾域連接；此外還有一到兩個(gè)識(shí)別特異DNA序列的功能域構(gòu)成C端，或以獨(dú)立的亞基形式存在。當(dāng)這些酶與底物結(jié)合時(shí)，它們或行使限制性內(nèi)切酶的功能切開(kāi)底物，或作為修飾酶將其甲基化。編輯ppt一些概念粘末端和平末端同尾酶同裂酶同識(shí)異切酶消化星號(hào)活力編輯ppt同裂酶：有時(shí)兩種限制性內(nèi)切酶的識(shí)別核苷酸順序和切割位置都相同，其差異只在于當(dāng)識(shí)別順序中有甲基化的核苷酸時(shí)，一種限制性內(nèi)切酶可以切割，另一種那么不能。例如HpaⅡ和MspⅠ的識(shí)別順序都是5’……CCGG……3’，如果其中有5’-甲基胞嘧啶，那么只有HpaⅡ能夠切割。這些有相同切點(diǎn)的酶稱為同裂酶〔同切酶或異源同工酶〕。

同裂酶和同尾酶：編輯ppt有時(shí)兩種酶切割序列不完全相同，但卻能產(chǎn)生相同的粘性末端，這類酶被稱為同尾酶，可以通過(guò)DNA連接酶將這類末端連接起來(lái)，但原來(lái)的酶切位點(diǎn)將被破壞，有時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生一個(gè)新的酶切位點(diǎn)。如XbaⅠ(T`CTAGA)、NheⅠ(G`CTAGC〕、SpeⅠ(A`CTAGT)切割的DNA序列不同，但均給出相同的“CTAG〞粘性末端。這些粘性末端連接后，以上的酶將不能再切割，但卻產(chǎn)生了一個(gè)新的4核苷酸的酶切位點(diǎn)，即BfaⅠ〔C`TAG)的酶切位點(diǎn)。同尾酶：編輯ppt限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用克隆〔有時(shí)與甲基化酶聯(lián)用〕鑒定〔基因片斷大小、正反向〕檢測(cè)突變〔識(shí)別位點(diǎn)，限制酶切圖譜的多態(tài)性〕制作Marker編輯ppt編輯ppt單酶切與雙酶切的選擇策略運(yùn)用載體的限制載體的自身環(huán)化〔挑選陽(yáng)性克隆的工作量〕克隆的方向〔鑒定〕編輯pptInsertEcoR1Xho11.9kb質(zhì)粒編輯ppt該實(shí)驗(yàn)用質(zhì)粒pCMV-Myc-T10經(jīng)EcoRⅠ單酶切后應(yīng)為5.7kb；用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后應(yīng)產(chǎn)生兩條DNA片段，一條是3.8kb，另一條是1.9kb〔如以以下圖〕。3.06.0EcoRIEcoRI&XhoIDNAMarker2.03.81.95.7編輯ppt

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性RFLPs(restrictionfragmentlengthpolymorphisms)1987年，第一張較完整的人基因連鎖圖，500多個(gè)RELP位點(diǎn)，定位了Huntington病，CF〔囊性纖維化〕和癌相關(guān)基因〔APC，DCC等〕編輯pptRFLP在遺傳病檢測(cè)中的應(yīng)用鐮狀細(xì)胞貧血癥〔globin，6〕，其GAGGTG的突變，可用RFLP〔MstII，CCTNAGG〕或PCR-SSCP檢出。甲型血友病〔FVIII－，XR〕可用PCR-RFLP檢出。142bp99bp編輯ppt引起鐮刀型紅細(xì)胞貧血癥的原因就是基因的點(diǎn)突變，即編碼血紅蛋白β肽鏈上一個(gè)決定谷氨酸的密碼子GAA變成了GUA，使得β肽鏈上的谷氨酸變成了纈氨酸，引起血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了根本的改變。β肽鏈基因上單個(gè)核苷酸的替換A→U恰好使該根本片段喪失了可被MstII或CvnⅠ切開(kāi)的一個(gè)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。由于基因突變改變了限制性酶切的結(jié)果，用Southernblot分析方法和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性〔簡(jiǎn)稱RFLP〕分析方法即可對(duì)鐮刀型紅細(xì)胞貧血癥胎兒做產(chǎn)前診斷，或?qū)Πl(fā)病家族成員的基因組型進(jìn)行分析。編輯ppt編輯ppt0.5μg的1kbDNALadder0.8%TAE瓊脂糖凝膠，EB染色

編輯ppt數(shù)據(jù)庫(kù)限制性內(nèi)切酶的數(shù)據(jù)庫(kù)rebase.neb/rebase其中含有的所有限制性內(nèi)切酶的完整表，包括識(shí)別的序列，甲基化的敏感性，商業(yè)信息和參考文獻(xiàn)。編輯ppt應(yīng)用中的注意點(diǎn)1、建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的酶切反響目前大多數(shù)研究者遵循一條規(guī)那么，即10個(gè)單位的內(nèi)切酶可以切割1μg不同來(lái)源和純度的DNA。通常，一個(gè)50μl的反響體系中，1μl的酶在1XBuffer終濃度及相應(yīng)溫度條件下反響1小時(shí)即可降解1μg已純化好的DNA。如果參加更多的酶，那么可相應(yīng)縮短反響時(shí)間；如果減少酶的用量，對(duì)許多酶來(lái)說(shuō)，相應(yīng)延長(zhǎng)反響時(shí)間〔不超過(guò)16小時(shí)〕也可完全反響。一般說(shuō)來(lái)，線性DNA比超螺旋DNA更易消化。比方，酶切1uglambdaDNA，需要1-2單位的酶，而酶切1ug質(zhì)粒DNA，需要3-5單位的酶。編輯ppt2、選擇正確的酶不言而喻，選擇的酶在底物DNA上必須至少有一個(gè)相應(yīng)的識(shí)別位點(diǎn)。識(shí)別堿基數(shù)目少的酶比堿基數(shù)目多的酶更頻繁地切割底物。假設(shè)一個(gè)GC含量50%的DNA鏈，一個(gè)識(shí)別4個(gè)堿基的酶將平均在每44〔256〕個(gè)堿基中切割一次；而一個(gè)識(shí)別6個(gè)堿基的酶將平均在每46〔4096〕堿基切割一次。內(nèi)切酶的產(chǎn)物可以是粘端的〔3'或5'突出端〕，也可以是平端的片段。粘端產(chǎn)物可以與相容的其它內(nèi)切酶產(chǎn)物連接，而所有的平端產(chǎn)物都可以互相連接編輯ppt3、加酶內(nèi)切酶一旦拿出冰箱后應(yīng)當(dāng)立即置于冰上。酶應(yīng)當(dāng)是最后一個(gè)被參加到反響體系中〔在參加酶之前所有的其它反響物都應(yīng)當(dāng)已經(jīng)加好并已預(yù)混合〕。酶的用量視在底物上的切割頻率而定。編輯ppt4、DNA待切割的DNA應(yīng)當(dāng)已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污劑或過(guò)多鹽離子的污染，以免干擾酶的活性。DNA的甲基化也應(yīng)該是酶切要考慮到的因素編輯ppt5、緩沖液對(duì)于每一種酶都提供相應(yīng)的最正確緩沖液，可保證酶活性。使用時(shí)的緩沖液濃度應(yīng)為1X。有的酶要求100μg/ml的BSA以實(shí)現(xiàn)最正確活性。不需要BSA的酶如果加了BSA也不會(huì)受太大影響編輯ppt6、反響體積內(nèi)切酶活力單位的定義是：1小時(shí)內(nèi)，50μl反響體積中，降解1μg的底物DNA所需的酶為一個(gè)活力單位。因此酶：DNA的反響比例可以由此確定。較小的反響體積更容易受到移液器誤差的影響。為了將甘油的濃度控制在5%以下，要注意酶的體積不要超過(guò)總體積的10%〔一般酶都貯存于50%的甘油中〕編輯ppt7、混合這是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反響完全，必須使反響液充分混合。我們推薦用槍反復(fù)吸取混合，或是用手指輕彈管壁混合，然后再快速離心一下即可。注意：不可振蕩！編輯ppt8、反響溫度大局部酶的反響溫度為37℃；從嗜熱菌中別離出來(lái)的內(nèi)切酶那么要求更高的溫度。一般為50-65℃不等編輯ppt9、反響時(shí)間1酶活單位的定義時(shí)間為1小時(shí)。如果參加的酶較多，可以相應(yīng)地縮短反響時(shí)間；反之，如果參加的酶量較少，也可以延長(zhǎng)時(shí)間以使反響到達(dá)完全編輯ppt10、終止反響如果不進(jìn)行下一步酶切反響，可用終止液來(lái)終止反響。在NEB我們使用如下反響終止液：50%的甘油，50mMEDTA〔pH8.0〕，和0.05%溴酚藍(lán)〔10μl/50μl反響液〕。如果要進(jìn)行下一步酶切反響，可用熱失活法終止反響〔65℃或85℃，20分鐘〕。熱失活并不能適用于所有的酶。此外，酚/氯仿抽提也可以用于終止反響。編輯ppt11、貯存大局部酶應(yīng)貯存于-20℃。少局部酶那么須在-70℃長(zhǎng)期保存。10XBUFFER和100XBSA于-20℃保存。BSA不能與NEBuffer混合后保存，否那么將會(huì)出現(xiàn)BSA沉淀編輯ppt12、穩(wěn)定性每隔1-2個(gè)月都會(huì)對(duì)所有的酶有一個(gè)活性檢測(cè)；最近的一次檢測(cè)結(jié)果將被貼在售出的每一管酶上。大局部酶在推薦的保存緩沖液里在-20℃條件下十分穩(wěn)定。高于-20℃條件下穩(wěn)定性將有所降低編輯ppt13、對(duì)照反響如果發(fā)現(xiàn)DNA底物不能被成功切開(kāi)，可以進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)以查明原因。具體方法如下：將不加內(nèi)切酶的底物DNA〔待切底物〕與參加了內(nèi)切酶的對(duì)照DNA〔有多個(gè)酶切位點(diǎn)〕同時(shí)進(jìn)行反響。假設(shè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明底物DNA降解，那么說(shuō)明DNA在純化過(guò)程中或反響液里引入了核酸酶污染；假設(shè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)底物DNA保持完整，而對(duì)照DNA被成功切開(kāi)，那么可以排除酶質(zhì)量的原因，此時(shí)可以將對(duì)照DNA和待切底物DNA混合起來(lái)再次進(jìn)行反響，以確定樣品中是否有抑制劑。如果有抑制劑存在〔