免疫實驗小鼠分離

實驗三小鼠脾單個核細(xì)胞的分離

—密度梯度離心法

實驗原理：

根據(jù)物理學(xué)中顆粒沉降原理，不同密度的物質(zhì)顆粒在其沉降運動中可因其密度的差別而處于不同的分布位置。利用此原理可設(shè)計一定密度的液體界面，將外周血中各種不同密度的細(xì)胞通過離心沉降而達到使其彼此分離的目的。

單個核細(xì)胞（PBMC）=淋巴細(xì)胞（95%）+單核細(xì)胞已知小鼠PBMC的密度約為1.088（人類約為1.077），而紅細(xì)胞與粒細(xì)胞的密度均大于1.088（人類均大于1.090）用密度為1.088±0.001（人類為1.077±0.001）的Ficoll分離液（PBMC密度略低于分離液）則可通過密度梯度離心方法，在分離液界面上收集PBMC。實驗原理：器材：（1）水平式離心機（2）顯微鏡（3）血球計數(shù)板、血蓋片（4）試管、滴管（5）定量移液器（6）刻度離心管（7）擦鏡紙試劑：（1）小鼠脾臟細(xì)胞懸液（2）淋巴細(xì)胞分離液（市售，密度：1.088±0.001）（3）生理鹽水（0.9%氯化鈉注射液）（4）白細(xì)胞稀釋液（5）0.4%錐蘭染液器材與試劑：操作步驟：將1ml小鼠脾細(xì)胞懸液混勻，用滴管沿盛有2ml淋巴細(xì)胞分離液的試管壁輕輕鋪于分離液面上。將該試管置水平式離心機中離心（1800rpm）15分鐘。（一定要平衡）操作步驟：離心后的各成份在試管中的分布位置如下圖：用滴管小心地直接插入白色絮狀的細(xì)胞層（含PBMC），吸出界面層細(xì)胞，移入另一試管內(nèi)。1.0881.088稀釋的懸液稀釋的懸液操作步驟：加入足量生理鹽水（N.S），用滴管輕輕上下混勻，然后離心（1000rpm）10分鐘，棄去上清液，將沉淀細(xì)胞充分搖勻，再用N.S洗滌1次。用0.3mlN.S將沉淀細(xì)胞稀釋，搖勻。取細(xì)胞懸液1滴加入等量白細(xì)胞稀釋液于另一試管中充分混勻，用計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)，計算出單個核細(xì)胞濃度（個/ml）。檢查細(xì)胞活力：取細(xì)胞懸液一滴加入等量錐蘭溶液于另一試管中充分混勻，用載玻片在顯微鏡下計數(shù)50~100個單個核細(xì)胞中著色的死細(xì)胞數(shù)。

單個核細(xì)胞濃度（個/ml）

（4大方格細(xì)胞總數(shù)）

4

細(xì)胞活力（%）

實驗結(jié)果記錄與分析

分離后活細(xì)胞數(shù)分離后細(xì)胞總數(shù)×10×2×103一大方格=1×1×0.1=0.1mm31

l=1mm31ml=1000mm3操作注意事項

分離液與脾細(xì)胞懸液的比例，一般以1:2~1:3為宜。分離時所取的離心速度與時間，因各臺離心機的離心半徑而異，需事先通過預(yù)試驗決定。加入脾細(xì)胞懸液時應(yīng)十分小心，注意保護試管內(nèi)的界面，勿使混淆而影響