細(xì)菌內(nèi)毒素定量分析

細(xì)菌內(nèi)毒素光度測(cè)定法試驗(yàn)講義講解董光宴1、光度測(cè)定法概述2、試劑和儀器3、標(biāo)準(zhǔn)曲線4、干擾試驗(yàn)5、檢查法湛江博康海洋生物1/24/20241一、光度測(cè)定法概述1、定量法的概念2、定量法的分類3、定量法的原理1/24/202421定量法的概念光度測(cè)定法分為濁度法和顯色基質(zhì)法：濁度法系利用檢測(cè)鱟試劑與內(nèi)毒素反響過程中的濁度變化而測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。根據(jù)檢測(cè)原理，可分為終點(diǎn)濁度法和動(dòng)態(tài)濁度法。動(dòng)態(tài)濁度法是檢測(cè)反響混合物的濁度到達(dá)某一預(yù)先設(shè)定的吸光度所需要的反響時(shí)間，或是檢測(cè)濁度增加速度的方法。1/24/20243定量法濁度法顯色基質(zhì)法動(dòng)態(tài)濁度法終點(diǎn)濁度法2定量法分類1/24/202443定量法的原理〔1〕動(dòng)力學(xué)曲線：細(xì)菌內(nèi)毒素與鱟試劑反響過程中，隨著反響的進(jìn)行，混合物會(huì)逐漸變混濁，內(nèi)毒素濃度越高濁度變化越快，濁度變化符合反響動(dòng)力學(xué)曲線。1/24/20245〔2〕細(xì)菌內(nèi)毒素含量與時(shí)間的關(guān)系：細(xì)菌內(nèi)毒素濃度與反響時(shí)間分別取對(duì)數(shù)后，將兩組數(shù)據(jù)用最小二乘法統(tǒng)計(jì)，可以得到直線：LgT=a+bLgC我們將這條直線稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線。1/24/20246〔3〕、數(shù)學(xué)原理原理：OD=-Lg〔It/Io〕0.02=-Lg〔It/Io〕It=95%Io1/24/20247二試劑和儀器光度測(cè)定法鱟試劑〔生產(chǎn)單位：湛江博康海洋生物，批號(hào)：0907104，檢測(cè)限：0.015EU/ml；規(guī)格為1.25ml/支〕細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水〔生產(chǎn)單位：湛江博康海洋生物，批號(hào)：0908030，規(guī)格：2ml/支〕1/24/20248細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品〔200966，120EU/支，中國(guó)藥品生物制品檢定所提供〕氯化鉀注射液〔規(guī)格：1g/10ml批號(hào)：0911211，生產(chǎn)廠家：河北某制藥廠〕細(xì)菌內(nèi)毒素定量檢測(cè)儀〔生產(chǎn)單位：天大天發(fā)科技有限，型號(hào)：BET-72〕1/24/20249三標(biāo)準(zhǔn)曲線1、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的條件2、標(biāo)準(zhǔn)曲線的選擇3、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作4、標(biāo)準(zhǔn)曲線有效的條件5、結(jié)果分析1/24/2024101制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的條件當(dāng)使用新批號(hào)的鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生了任何可能會(huì)影響檢驗(yàn)結(jié)果的改變時(shí)，需進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)。用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素配成溶液，并制成至少3個(gè)濃度的稀釋液〔相鄰濃度間稀釋倍數(shù)不得大于10〕，最低濃度不得低于所用鱟試劑的標(biāo)示檢測(cè)限。1/24/2024112標(biāo)準(zhǔn)曲線的選擇制做標(biāo)準(zhǔn)曲線的內(nèi)毒素濃度可選擇10倍、5倍、4倍和2倍稀釋的等比系列點(diǎn)，也可選擇非等比系列點(diǎn)。一般情況下，我們不推薦10倍和2倍等比系列點(diǎn)，10倍等比系列點(diǎn)〔如10EU/ml、1EU/ml、0.1EU/ml和0.01EU/ml〕跨度大，其相關(guān)系數(shù)R和準(zhǔn)確性都受到一定限制；1/24/2024122倍等比系列點(diǎn)〔如0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml和0.06EU/ml〕跨度太小，其相關(guān)系數(shù)R和準(zhǔn)確性都較好，但很不實(shí)用。我們推薦選用4倍等比系列點(diǎn)〔如2EU/ml、0.5EU/ml、0.125EU/ml和0.03EU/ml〕跨度適中，其相關(guān)系數(shù)R和準(zhǔn)確性都較好，而且非常實(shí)用。1/24/2024133標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作3.1內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的溶解稀釋首先將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水1ml溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘，然后制備成2EU/ml、1EU/ml、0.5EU/ml、0.125EU/ml和0.03EU/ml備用。1/24/202414200EU/ml20EU/ml2.0EU/ml1.0EU/ml0.5EU/ml0.03EU/ml0.125EU/ml0.3ml0.3ml2.7ml2.7ml1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml1.5ml0.5ml0.5ml圖示1/24/2024153.2定量法鱟試劑的溶解分裝

將復(fù)溶好的光度測(cè)定法鱟試劑分裝到14支定量分析專用試管中，每管分裝0.1ml。定量法鱟試劑定量試管每管0.1ml1/24/2024163.3加樣將內(nèi)毒素參加定量分析專用試管中，每個(gè)濃度做3支平行管，剩下兩管參加BET水作為陰性對(duì)照，每管加樣量均為0.2ml。2EU/ml0.5EU/ml0.125EU/ml0.03EU/mlBET水1/24/202417注：產(chǎn)品名稱：有機(jī)玻璃試管架用

途：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查定量法中用于擺放小試管。特

點(diǎn)：有機(jī)玻璃材料可保護(hù)定量法小試管，防止定量法小試管被磨花而影響試驗(yàn)結(jié)果。1/24/2024183.4檢測(cè)加樣完畢后用封口膜密封試管，將每支試管在旋渦混合器上點(diǎn)1-3秒，然后將試管對(duì)應(yīng)插入已恒溫的定量檢測(cè)儀〔37℃〕，儀器開始自動(dòng)采集數(shù)據(jù)。注：封口膜的優(yōu)點(diǎn)規(guī)

格：4IN×35FT〔4英寸×35英尺〕特

點(diǎn)：進(jìn)口代銷，比較適合用于定量法專用試管的封口，清洗時(shí)不留任何殘留物。1/24/2024194標(biāo)準(zhǔn)曲線有效的條件當(dāng)陰性對(duì)照的反響時(shí)間大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反響時(shí)間，將全部數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析。根據(jù)線性回歸分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)〔r〕的絕對(duì)值應(yīng)該大于或等于0.980，試驗(yàn)方為有效。平行管的變異系數(shù)＜10%。1/24/2024205結(jié)果分析內(nèi)毒素反應(yīng)時(shí)間變異系數(shù)實(shí)測(cè)內(nèi)毒素0>720000>72002.07900.36%2.01182.07940.511591.01%0.50220.511400.12516200.34%0.12170.12516340.0323980.04%0.03180.032381

標(biāo)準(zhǔn)曲線：LogT，相關(guān)系數(shù)：

=-0.9999,標(biāo)準(zhǔn)曲線符合規(guī)定。1/24/202421四干擾試驗(yàn)1、限值確實(shí)定2、干擾試驗(yàn)濃度的計(jì)算3、檢測(cè)濃度的選擇4、干擾試驗(yàn)溶液的制備5、供試品溶液的稀釋6、干擾試驗(yàn)的制備方法7、干擾試驗(yàn)加樣8、判斷的標(biāo)準(zhǔn)9、試驗(yàn)結(jié)果分析10、結(jié)論1/24/2024221限值確實(shí)定2010版《中國(guó)藥典》二部正文1014頁(yè)【氯化鉀注射液】。L=0.12EU/mg1/24/2024232干擾試驗(yàn)濃度的計(jì)算按照中國(guó)藥典2010年版提供的公式計(jì)算最大有效稀釋倍數(shù)〔注：其中標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點(diǎn)λ為0.015EU/ml〕。最大有效稀釋倍數(shù)：MVD=CL/λ=100Х0.12/0.015=800倍1/24/2024243檢測(cè)濃度的選擇樣品限值表達(dá)方式為EU/ml，直接選用其無干擾濃度并填寫相應(yīng)稀釋倍數(shù)即可；樣品限值表達(dá)方式為EU/mg，無論其干擾情況如何，我們推薦以1mg/ml為初始濃度，選用其以下的無干擾濃度并填寫從1mg/ml開始的相應(yīng)稀釋倍數(shù)，這樣檢測(cè)結(jié)果即為樣品每ml或mg中內(nèi)毒素的量。我們將檢測(cè)結(jié)果直接與限值比較即可。1/24/2024254干擾試驗(yàn)溶液的制備編號(hào)內(nèi)毒素濃度被加入內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A無1.0mg/ml或0.5mg/ml至少2B標(biāo)準(zhǔn)曲線的中點(diǎn)（或附近點(diǎn)）的0.5EU/ml（設(shè)為λm）1.0mg/ml或0.5mg/ml至少2C2.0EU/ml、0.5EU/ml、0.125EU/ml、0.03EU/ml四個(gè)濃度檢查用水每一濃度至少2D無檢查用水至少21/24/2024265供試品溶液的稀釋

用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將氯化鉀注射液稀釋到2.0mg/ml、1.0mg/ml和0.5mg/ml備用。操作過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作規(guī)程，保證無外源物質(zhì)的干擾。

1/24/20242710.0mg/ml2.0mg/ml1.0mg/ml0.5mg/ml0.3ml2.7ml1.0ml1.0ml0.3ml4.0ml1.0ml0.3ml100mg/ml圖示1/24/2024286干擾試驗(yàn)的制備方法取氯化鉀注射液的2.0mg/ml、1.0mg/ml稀釋液分別參加四支試管中，每管加0.3ml，然后分別吸取0.3ml的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度為1.0EU/ml按以下圖參加其中兩支試管中，另外吸取0.3ml的檢查用水參加其中另外兩支試管中。將這四支管混合均勻即可得到氯化鉀注射液的1.0mg/ml、0.5mg/ml稀釋液干擾試驗(yàn)所需樣品溶液。1/24/202429氯化鉀注射液內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0EU/ml0.3ml0.3ml0.3ml(2.0mg/ml)0.3ml(2.0mg/ml)0.3ml(1.0mg/ml)0.3ml(1.0mg/ml)BET水0.3ml0.3ml圖示1/24/2024307干擾試驗(yàn)加樣

取分裝了0.1ml定量法鱟試劑的定量專用試管10支，每個(gè)濃度做2支平行管，氯化鉀注射液的1.0mg/ml、0.5mg/ml稀釋液干擾試驗(yàn)各4支；另做2支陰性對(duì)照，每管加樣量均為0.2ml。加樣完畢后密封試管，將每支試管在旋渦混合器上點(diǎn)1-3秒，然后對(duì)應(yīng)插入定量檢測(cè)儀，儀器開始采集數(shù)據(jù)。

1/24/2024310.1ml鱟試劑0.1ml鱟試劑0.1ml鱟試劑1mg/ml的加樣0.2ml0.2ml0.5mg/ml的加樣0.2ml陰性對(duì)照?qǐng)D示1/24/2024328判斷的標(biāo)準(zhǔn)按所得線性回歸方程分別計(jì)算供試品溶液和含標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的供試品溶液的內(nèi)毒素含量Ct和Cs，再按下式計(jì)算該試驗(yàn)條件下的回收率〔R〕。R=(CS-Ct)/λm×100%當(dāng)內(nèi)毒素的回收率在50%-200%之間，那么認(rèn)為在此該試驗(yàn)條件下供試品溶液不存在干擾作用。1/24/202433圖示回收率：R=(CS-Ct)/λm×100%=×100%1/24/2024349試驗(yàn)結(jié)果分析樣品氯化鉀注射液干擾試驗(yàn)結(jié)果1/24/202435回收率R：以樣品濃度C=1.0mg/ml〔即稀釋倍數(shù)為1)以9、10、11和12管為例，計(jì)算該濃度下的回收率〔R〕。R=(CS-Ct)/λm×100%=〔〕/0.5×100%=90%注：如果檢測(cè)結(jié)果小于檢測(cè)限，計(jì)算回收率時(shí)以0計(jì)。 1/24/20243610結(jié)論結(jié)論：依據(jù)<中國(guó)藥典>2010版附錄“細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法〞，氯化鉀注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查干擾試驗(yàn)1.0mg/ml和0.5mg/ml的稀釋液符合試驗(yàn)要求，對(duì)鱟試驗(yàn)沒有干擾。常規(guī)檢查選用其中任一濃度即可。1/24/202437五檢查法1檢測(cè)濃度的選擇如樣品有干擾作用，選擇符合干擾試驗(yàn)要求的第二個(gè)濃度作為日常檢查的濃度。1/24/2024382試驗(yàn)有效條件試驗(yàn)必須符合以下三個(gè)條件方為有效：標(biāo)準(zhǔn)曲線要符合“可靠性試驗(yàn)〞中的要求；計(jì)算出的內(nèi)毒素的回收率要在50%-200%的范圍內(nèi)；陰性對(duì)照的反響時(shí)間應(yīng)大于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低濃度的反響時(shí)間。1/24/202439

3結(jié)果判斷假設(shè)供試品溶液所有平行管的平均內(nèi)毒素濃度乘以稀釋倍數(shù)后，小于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判供試品符合規(guī)定。假設(shè)大于或等于規(guī)定的內(nèi)毒素限值，判供試品不符合規(guī)定。1/24/202440六、光度測(cè)的特點(diǎn)1、定量?jī)x器取值方法2、定量法的特點(diǎn)3、動(dòng)態(tài)濁度法和凝膠法的比較1/24/202441濁度法取值法透光率反應(yīng)時(shí)間取值法T0.95光密度反應(yīng)時(shí)間取值法T0.02濁度反應(yīng)時(shí)間取值法T501定量?jī)x器取值方法1/24/2024421.1透光率反響時(shí)間取值法T0.95在鱟試驗(yàn)中，細(xì)菌內(nèi)毒素濃度與反響到達(dá)某一狀態(tài)的時(shí)刻有關(guān)，只要測(cè)出這一時(shí)間就可算出內(nèi)毒素的實(shí)際濃度，這一過程叫反響時(shí)間取值方法。透光率反響時(shí)間取值法使用透光率描述鱟試劑的濁度變化。日本的ET-201型儀器采用該方法，即t0.95法。但該法所描述的透光率反響曲線與反響產(chǎn)物的量呈非線性關(guān)系。1/24/2024431.2光密度反響時(shí)間取值法T0.02光密度限值法預(yù)設(shè)一個(gè)光密度OD值，當(dāng)反響曲線從開始上升到預(yù)設(shè)值時(shí)經(jīng)理的時(shí)間作為反響時(shí)間，此方法的優(yōu)點(diǎn)是時(shí)刻變化的OD值與反響產(chǎn)物的數(shù)量成正比，也就是吸光度變化曲線與凝膠產(chǎn)物的產(chǎn)生關(guān)系呈線性，取OD值上升0.02作為預(yù)設(shè)點(diǎn)，該點(diǎn)在反響曲線上的位置為濁度開始快速變化的時(shí)期，該取值能夠快速、穩(wěn)定的獲得反響時(shí)間。1/24/2024441.3濁度反響時(shí)間取值法T50濁度-時(shí)間曲線法每一管的濁度總是從0-1，這就是所謂“歸一法〞，這種動(dòng)態(tài)濁度法必須求出濁度到達(dá)0.5的時(shí)間t50，t50與拐點(diǎn)極為接近，用該點(diǎn)代替拐點(diǎn)。T50法很有優(yōu)勢(shì)，但要