基因重組與基因工程課件

基因重組與基因工程

GeneticRecombination&GeneticEngineering李凌基因研究的三步曲一、20世紀(jì)50年代以前：染色體遺傳學(xué)階段二、20世經(jīng)50年代—70年代：

基因的分子生物學(xué)階段三、20世經(jīng)70年代至今：DNA重組工程學(xué)的發(fā)展，基因研究走向反向生物學(xué)階段基本概念基因重組與基因工程第一節(jié)自然界的基因轉(zhuǎn)移與重組一、接合作用(conjugation)二、轉(zhuǎn)化(transformation)及轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)三、轉(zhuǎn)座(transposition)四、基因重組第二節(jié)重組DNA技術(shù)一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念二、重組DNA技術(shù)基本原理三、重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)的關(guān)系接合作用：當(dāng)細(xì)胞與細(xì)胞、或細(xì)菌通過菌毛相互接觸時(shí)，質(zhì)粒DNA就可以從一個(gè)細(xì)胞（細(xì)菌）轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞（細(xì)菌）的方式。一、接合作用(conjugation)轉(zhuǎn)化：通過自動(dòng)獲取或人為地供給外源DNA，使細(xì)胞或培養(yǎng)的受體細(xì)胞獲得新的遺傳表型。二、轉(zhuǎn)化(transformation)第二節(jié)

重組DNA技術(shù)一、重組DNA技術(shù)相關(guān)概念（一）DNA克隆克隆：來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合?？寺』韩@取同一拷貝的過程。

DNA克?。ǚ肿涌寺　⒒蚩寺?、重組DNA）：應(yīng)用酶學(xué)方法，在體外將外源性遺傳性物質(zhì)與載體結(jié)合成重組DNA分子，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞、篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細(xì)胞，再進(jìn)行擴(kuò)增、提取獲得大量同一DNA分子的過程。基因工程基因工程：重組DNA工藝學(xué)生物工程基因工程蛋白質(zhì)工程酶工程細(xì)胞工程基因工程

基因工程：是用分離純化或人工合成的DNA在體外與載體DNA結(jié)合，成為重組DNA，用以轉(zhuǎn)化宿主（細(xì)菌或其它細(xì)胞），篩選出能表達(dá)重組DNA的活細(xì)胞，加以純化、傳代、擴(kuò)增，成為克隆，產(chǎn)生出人類所需要的基因產(chǎn)物或改造、創(chuàng)造新的生物類型。（二）工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶

識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶

催化DNA中相鄰的5’磷酸基和3’羥基形成二酯鍵DNA聚合酶I

a.合成cDNA的第二條鏈b.缺口平移c.測序d.補(bǔ)平反轉(zhuǎn)錄酶

合成cDNA多聚核苷酸激酶

催化多聚核苷酸5‘羥基末端磷酸化末端轉(zhuǎn)移酶

同聚物加尾堿性磷酸酶

切除末端磷酸基限制性核酸內(nèi)切酶主要來源于原核生物，具有識(shí)別自身DNA或異源DNA的功能，通過切割破壞或限制異源DNA分子侵入宿主細(xì)胞來保護(hù)自身。識(shí)別特性：具有雙鏈對(duì)稱的回文結(jié)構(gòu)

↓5’–GAATTC-3’3’–CTTAAG-5’↑Restriction-modificationsystemrestrictionendonucleasemethylaseStickyendBluntend限制性核酸內(nèi)切酶命名：HindIII屬種株同一株具不同特異性酶分類：I、II、III類，常用II類異源同功酶：識(shí)別及切割位點(diǎn)相同同尾酶：產(chǎn)生相同的粘性末端

BamHI:G↓GATCCSau3AI:↓GATC（三）目的基因cDNA：complementaryDNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成的、與RNA互補(bǔ)的單鏈DNA?；蚪MDNA：代表一個(gè)細(xì)胞或生物體整套遺傳信息的所有DNA序列。（四）基因載體克隆載體（cloningvector)攜帶目的基因、并實(shí)現(xiàn)目的基因的無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子?？沙洚?dāng)克隆載體的DNA分子有：質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA和病毒DNA常用的為SV40，通過感染方式將其DNA送入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行增殖。目前應(yīng)用相對(duì)較少。

載體(vector)供插入目的基因并將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)或復(fù)制的運(yùn)載工具載體具備條件1.自主穩(wěn)定復(fù)制2.多克隆位點(diǎn)3.遺傳標(biāo)記4.插入容量大5.分子量小，拷貝多6.安全載體的分類按來源：質(zhì)粒、噬菌體、病毒按產(chǎn)物：克隆載體、表達(dá)載體按宿主細(xì)胞：原核細(xì)胞載體、真核細(xì)胞載體二、重組DNA技術(shù)的基本原理1.目的基因的獲取2.克隆載體的選擇與構(gòu)建3.外源基因與載體的連接4.重組DNA導(dǎo)入受體菌5.重組體的篩選6.克隆基因的表達(dá)DNA克隆的基本過程分：分離目的基因切：對(duì)目的基因和載體適當(dāng)切割接：目的基因與載體連接轉(zhuǎn)：重組DNA轉(zhuǎn)入受體菌篩：篩選出含有重組體的受菌體一、分—載體和目的基因的分離（一）載體1.質(zhì)粒2.噬菌體3.病毒常用逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒(二)目的基因的來源

1.從染色體DNA中分離2.人工合成3.從mRNA合成cDNA4.基因文庫二、切—限制性內(nèi)切酶的應(yīng)用

酶辨認(rèn)的序列和切口說明BamHⅠ…GGATCC…六核苷酸…CCTAGG…粘端切口EcoRⅠ…GAATTC…六核苷酸…CTTAAG…粘端切口SmaⅠ…CCCGGG…六核苷酸…GGGCCC…平端切口三、接——

把載體和目的基因連接成重組體1.粘端連接2.平端連接3.尾接法四、轉(zhuǎn)—重組體的轉(zhuǎn)化1.重組體導(dǎo)入大腸桿菌（1）氯化鈣法（2）電擊法（3）體外包裝法2.重組體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞（1）磷酸鈣共沉淀法（2）脂質(zhì)體介導(dǎo)法（3）病毒感染法（4）顯微注射法五、篩—DNA重組體的篩選與鑒定1.根據(jù)重組載體的表型進(jìn)行篩選2.DNA限制酶切圖譜分析3.利用核酸雜交和放射自顯影進(jìn)行鑒定基因工程技術(shù)策略分：

基因載體

目的基因

質(zhì)粒噬菌體病毒直接分離cDNA人工合成基因文庫切：

限制性內(nèi)切酶有缺口的載體目的基因接：

連接酶粘端連接平端連接尾接法重組體轉(zhuǎn)：