膠體金試紙條的制備-圖文

膠體金試紙條的制備—圖文.ppt 目錄

膠體金技術(shù)的發(fā)展膠體金技術(shù)的種類?膠體金免疫層析(GoldImmune-ChromatographicAssay,GICA)技術(shù)是結(jié)合了膠體金技術(shù)和免疫層析技術(shù)發(fā)展而來的，然本質(zhì)為一種固相反應(yīng)的ELISA,并用膠體金來代替底物顯色。?免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)\'膠體 金標(biāo)記實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等序分子被吸附到被過程。 膠體金技術(shù)的發(fā)展

A1939—-雛形Kausche等把煙草花葉病毒吸附到金顆粒上在電 子顯微鏡下觀察金離子呈高電子密度。>1971—一作為標(biāo)記物應(yīng)用于免疫組織化學(xué)研究

Faulk等首先將兔抗沙門菌抗血清與膠體金顆粒結(jié) 合，用直接免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)常測沙門菌的表面抗原。74—實(shí)現(xiàn)間接免疫金染色法 膠體金技術(shù)的種類及優(yōu)點(diǎn)

?快速免疫金滲濾法(immuogoldfiltrationassay,IGFA)即穿流式(flowthrough)的固相膜施疫測定。 主要由由部分組成：膜滲濾裝置和標(biāo)記結(jié)合物。前者為一塑料小盒，其中填滿吸水性物質(zhì)，面上緊貼放置一片吸附有抗體(以雙抗體夾心法測抗原為例)的硝酸纖維膜,標(biāo)記結(jié)合物為免疫金。?免疫層析法(immunochromatogra-phy,ICA)是繼IGFA之后發(fā)展起來的另」種固相膜免疫測定,與IGFA利用微局限性膜的過濾性能不同，免疫層析法中滴加在膜一端的樣品溶液受膜的毛細(xì)管作用(基于層析作用的橫流(lateralflow) )向另一端移動(dòng)。移動(dòng)過程中被分析物與固定在膜上某一位域的受體(抗原或者抗體)結(jié)合而被固相化，無關(guān)物質(zhì)則越過該區(qū)域而被分離，然后逋過標(biāo)記物顯色來判定試驗(yàn)結(jié)果，以膠體金為標(biāo)記物的實(shí)驗(yàn)稱為膠體金兔疫層析試驗(yàn)。. 免疫膠體令技術(shù)的特點(diǎn)

A優(yōu)點(diǎn):

?檢測方底簡單而快速，數(shù)分鐘即可得出結(jié)果;?不需儀器設(shè)備，操作人員不需特殊訓(xùn)練；

?試劑穩(wěn)定，適用于單份測定；

?無污染;

?GICA的特點(diǎn)是單一試劑，一步操作。小型實(shí)驗(yàn)室 即有條件開發(fā)生產(chǎn)。申廣為應(yīng)用的方法i[1/

成為目前照病人身邊檢驗(yàn)”（產(chǎn)扁上?？侫不足：

金免疫測定中應(yīng)用的是單份試齊l難于進(jìn)行質(zhì)量控制。即使是同一批生產(chǎn)的試劑，也很難保證每個(gè)試劑的同一性。因此金免疫測定一般只能用于定性試驗(yàn)。其定量檢測和靈敏度的提高還有賴于新原料和新材料的開發(fā)與應(yīng)用。蔓生日1堡故電插里口覦《照,范電改進(jìn)，己艘GICA試劑和匹配的簡便測讀器Cardi精密度和選確性均符合f『測定要膠體金的合成? 還原法（1905年）可合成3nm左右大小的金顆粒；? 還原法（1925年）經(jīng)改良后，可合成5 12nm大小的 金顆粒；? 壞血酸,原法（1958年）可合成6 13nm大小的金顆粒? 檸檬酸三鈉后原法（1973年）可合成5nm、15nm、30nm 、60nm大小的金顆粒；

? 乙醇一超聲波述原法（1980年）可合成6 10nm大小的金 顆拉； /?婕）單寧酸一檸檬酸三南哂法（1985 小的金顆粒/「M 膠體金合成制備膠體金試紙條常用的一般是檸檬酸三鈉還原法/J，將100ml的0.1%HAuCl4加入200ml的錐形瓶中,并 將其置于攪拌電熱爐上，加入一個(gè)磁力條并將溶液加熱至沸騰.?向沸騰的溶液中加入1.5ml的01％二合水檸檬酸三鈉，Na3c6H5O7.2H2。當(dāng)獲得深紅/顏色的溶液時(shí)停止加膠體金的合成20r115h2040SO80膠體金1%檸檬酸呈色Amax粒徑(nm)

16三鈉加入量(ml)*

ZOO518nm0h24.51.50522nm411.00525nm535nm71.50.70Soldiameter(nm)?注意事項(xiàng)

(1)氯金酸易潮解，應(yīng)干燥、避光保存。(2)氯金酸對金屬有強(qiáng)烈的腐蝕性，因此在配制氯金酸水溶液時(shí)，不應(yīng)使用金屬藥匙稱量氯金酸(3)用于制備膠體金的蒸儲(chǔ)水應(yīng)是雙蒸儲(chǔ)水或三蒸儲(chǔ)水，或者是高質(zhì)量的去各子水。(4)是以制備膠體金的玻暗容器必須是絕贈(zèng)青潔的，用前應(yīng)先經(jīng)酸洗正用蒸餡水沖凈

硅化處理的，硅化方法可用5%隨早

溶液浸泡數(shù)分鐘，柯蒸偏水沖南臨 膠體金的質(zhì)量鑒定透射電鏡下觀察其顆粒大小及均勻度理想的金顆粒大小基本相等

,均勻一致，無橢圓形及多

角形的金顆粒存在0優(yōu)質(zhì)金顆粒和劣質(zhì)金顆粒Good馴d

劣質(zhì)金彌形不均一，且

非球形F高膠體金的蛋白標(biāo)記一.4^1_(a)charge

0)hydtophobie(c)dative Fc

Lysln9+Tryptophan自Cysteine5H圖1-13抗體與膠體金結(jié)合示意圖圖人12股體金糧粒結(jié)構(gòu)

Fig.1-12Sb'LtctuieofacolloidalgoldpartideFig.1-13Schematicoftheantibody-goldcomplex'雙電層結(jié)構(gòu)保證了膠體金的穩(wěn)定蛋白通常帶有多種電荷，尚蛋白帶正電時(shí)，能與膠體金所帶的負(fù)性，使金顆粒始終以懸浮狀態(tài)存在口白中的確膠體金溶液通常由呈單一分散狀前將蛋白

觸蛋口則態(tài)的金顆粒組成，金顆粒直徑在1-100nm之間，而穩(wěn)軍印金溶液則要求金顆粒維持在票，審就直徑不變。 潭第3 金標(biāo)樣本程序?將膠體金調(diào)整至正確的pH值 膠體金調(diào)整正確的pH值

膠體金與蛋白質(zhì)的結(jié)合成功與否，取決于pH值，一般只有在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)(PI)略偏堿的條件下二者才能牢固地結(jié)合，因此，標(biāo)記之前須將膠體金溶液的pH值調(diào)至待標(biāo)記蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)略偏堿。' 需要提禽膠體金的pH值時(shí)可用O.lmolK2co3,需要降低膠體金的pH值時(shí)可用 測定金溶液的pH可能損害pH測定計(jì)的探頭，因此；一般用精事的pH試紙測定其pH即可.蛋白類型PH蛋白類型PHIgG9.0類卵粘蛋白4.8離子交換的IgG7.6血漿酮藍(lán)蛋白7.0親和層析抗體8.2脫唾液酸球蛋白6.0-6.5單克隆抗體8.2小牛血清白蛋白6.0-6.5F(ab)27.2牛血清白蛋白5.2-5.5SPA5.96.2牛血清白蛋白結(jié)合肽4.0-4.5藤麻植物血凝素8.0牛血清白蛋白結(jié)合胰島素5.3花生凝集素6.3霍亂毒素6.9HelixPromatiaLectin7.4破傷風(fēng)毒素6.9大豆凝集素6.1RNA酶9.0—9.2LensCularisLectin6.9DNA酶6.0四邊形蓮花凝集素6.3低密度脂蛋白 5.5

10.0—6.4-6.6, i

So荊豆凝集素6.33?巨球蛋白甘露聚糖7.0抗生物素蛋白過氧化物酶7ST.2鏈霉抗生物素蛋白A最小蛋白用量的碓定?(1)光電比色法：制備一系列不帥祜20￡5 30 35 40祭白任用量h45505560,分別加入5ml膠體/中，迅速混勻

580nm之間測定，以6.D值為縱坐標(biāo)—取曲線最先與橫軸相接近的那一點(diǎn) 心.處的蛋白質(zhì)用量為最適穩(wěn)定量.圖L弓「中10nm的膠體金溶液中蛋白質(zhì)的最適穩(wěn)定量為45pg/mL?(2)目測法：以目測法確定膠體金與待標(biāo)記蛋白質(zhì)用量比例，將標(biāo)記的蛋白質(zhì)逐級稀釋后(由5pg45兇另設(shè)對照管)，各取等體積順序加入一系列裝有1ml膠體金的試管中，5min后，在上述各管內(nèi)分別加入0.1ml10%氯化鈉，依表順序進(jìn)行。表8膠體金標(biāo)記單克隆抗體最低檢定量的測定Tabk8Determinetheoptimalproportionincolloidalgoldandantibody膠體金(ml)123456111111K2CO3(|L1)151515151515012.52537.5500蛋白HDPB(jil)10087.57562.5502001001001001001000NaCL(pl)發(fā)現(xiàn)號管出現(xiàn)黑色沉淀且紅色全）即為4然能保持紅色，但懸管底也出現(xiàn)了一定4、5號管顏色無變化對照顏色一致號管般月揖。 最終結(jié)合季(McAb)

?取100ml金溶液，調(diào)整pH值至8.2

?調(diào)整濾過和離心的抗體溶液(0.1pg/pl)至 pH8.2

?當(dāng)金溶液在快速攪拌時(shí)要逐滴加入定量的 抗體(蛋白最小濃度量加10%即蛋白穩(wěn)定 *.),大約5分鐘加完

?在金標(biāo)溶液中加入10ml濾過的10%BSR底·超速離心法、凝膠過濾法幾種免疫金探針離心純化條件 純化- \ 時(shí)件/min

義

30

甘

J'j兒膠體金顆粒\ /nmpH標(biāo)記蛋白質(zhì)/離心力/g59.0羊抗人IgG45000108.2 McAb '6.5，鏈霉親和素45000151200007206.0竄葩兔IgG

Mm能涉109.0膠體金免疫層析法試劑的組成圖2-1免疫層析試紙模式示意圖Samplepad；樣品墊jConjugatepad；膠金墊；Testline：檢測線；Controlline；質(zhì)控線；NCmembiane；NC膜；Absorbentpad：吸水墊；PCVsheet：支撐板Fig2-1Schematicoftheinimunochromatograpl)icstripdevice?樣品墊(SamplepZd)：

玻璃纖維、聚酯膜、相素輸紙、無紡布等多種材質(zhì)，多種規(guī)格，批間穩(wěn)定。樣品墊的作用：減緩樣品滲透速度，有利于樣品在結(jié)合墊上均勻分布去除樣品中舂質(zhì)顆粒；

調(diào)節(jié)樣品液6H值或粘度等。、異，提高試驗(yàn)的靈敏度。通章可以將洗 阻滯劑及鹽滲入樣本墊然后加以干燥，樣品墊可使用化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行浸漬處理,用復(fù)雜辨識(shí)劑浮跡緩沖液中麻煩?結(jié)合墊(Conjugatepad)：.玻璃纖維、聚酯膜、纖維素濾紙、無紡布等多種材質(zhì)，多種規(guī)格，批間穩(wěn)定。結(jié)合墊的作用主要為：-

---吸附一定量的金標(biāo)結(jié)合物顆粒;

吸附并持續(xù)不斷的將樣品轉(zhuǎn)移到NC膜上；保持金標(biāo)結(jié)合物顆粒的穩(wěn)定性；

保證金標(biāo)結(jié)合物顆粒定量完全釋放等。?硝酸纖維素膜（Nitrocellulose^:—般使用Millipoie,MDI,S&S,whatman等國外公司的硝酸纖維素膜。NC膜的作用；- 在檢測線和對照線條帶區(qū)域固庫抗體；- 樣品在加2膜上流動(dòng)并與試劑混合發(fā)生免疫反應(yīng)；- 反應(yīng)在NC膜上顯色，讀檢測結(jié)果NC膜的重要參藏孔徑、對稱性、層析速度、表南活性劑、蛋白結(jié)合力、 硝酸纖繼膜的選擇

?膜的分類標(biāo)準(zhǔn)伽m和s)

Um:指的是膜孔徑

換算情況大鄴為：8pm=135s；6pm=180s

?不同秒數(shù)的膜對反應(yīng)的影響

通過速度越快和包被在T線的物質(zhì)反應(yīng)時(shí)間也就越短，讀 數(shù)快，那么靈敏度也就越低。反之，反應(yīng)時(shí)間長，讀數(shù)慢 ,也就靈敏度高。同時(shí)還有一個(gè)問題是，反應(yīng)時(shí)間越長， 發(fā)生非特異性結(jié)合的可能性就越大，所以過長時(shí)間的反應(yīng) 不一定就能夠真正的提升靈敏度；?吸收墊(AbsorbentPad):

提供高吸收率、高容量以及海對穩(wěn)定吸收率的吸收紙；吸收紙的作用：主要表現(xiàn)在控制樣品的流速，促進(jìn)虹吸作用以及使試劑跨過膜而不僅僅移到膜區(qū)?片材：不干膠塑料襯底, 膠體金免疫層析試紙模式?雙抗體夾心模式

疫病抗原檢測

-競爭模式小分子物質(zhì)檢測?SPA/蛋白G模式雙抗體夾心模式 判定 檢測線質(zhì)控線陽性 顯色 顯色陰性 不顯色 顯色Antigen mAb-gold丫ployAb ndantibody圖1-14抗原檢測原理圖Fig.1-14Schematicofateststripforthedetectionofantigen競爭模式判定 檢測線'質(zhì)控線陽性 不顯色 顯色陰性 顯色 顯色SPA/G蛋白模式判定 檢測線質(zhì)控線陽性 顯色 顯色陰性 不顯色 顯色圖1-15抗體檢測原理圖Fig.1-15Schematicofateststripfortliecletectionofantibodies 膠體金免疫層析試紙的應(yīng)用?在獸藥殘留檢測中的應(yīng)用

Zhang等用克倫特羅制備的單克隆抗體標(biāo)記膠體金作為檢測探針，然后將偶 聯(lián)BSA的克倫特羅作為T線，以競爭模式組裝成試紙，用于樣品的克倫特羅 殘留檢測，為我國食品安全檢測提供了有效的工具。之后Zhang的團(tuán)隊(duì)采用 同樣的模式制備并組裝成功兩類獸藥殘留檢測試紙，分別為磺胺間甲氧喀咤 、