第六章 微生物的遺傳變異與育種

第六章微生物的遺傳變異與育種第一節(jié)遺傳變異的物質(zhì)根底第二節(jié)基因突變和誘變育種第三節(jié)微生物的基因重組第四節(jié)菌種的保藏及衰退與復壯遺傳〔heredity,inheritance〕和變異〔variation〕是一切生物體最根本的屬性之一。從遺傳學的角度看，微生物有許多重要的生物學特性：如個體簡單、生長繁殖快、營養(yǎng)體一般為單倍體、易于人工培養(yǎng)、易于積累發(fā)酵產(chǎn)物等，因此現(xiàn)代生物學中研究中微生物是研究的熱點?！?〕遺傳——是指生物的親代的遺傳信息傳遞給子代的特性，包括親代的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化特性在子代中重現(xiàn)出來?！?〕變異——指生物體在某種外因或內(nèi)因的作用下所引起的遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)或數(shù)量的改變，導致性狀的改變。且變化后的新性狀是穩(wěn)定的、可遺傳的。〔3〕表型——是指某一生物體所具有的一切外表特征和內(nèi)在特性的總和，是遺傳型在適宜環(huán)境條件下通過代謝和發(fā)育而得到的具有表達。所以它于遺傳型不同，是一種現(xiàn)實性〔具體性狀〕?！?〕遺傳與變異的關(guān)系：是生物體根本的屬性，二者相互依存。沒有遺傳物種就不能延續(xù)下去；沒有變異生物就不能進化，正因為生物有遺傳變異這種屬性，為育種工作提供了理論依據(jù)，通過遺傳保持了物種的穩(wěn)定性，通過變異促使產(chǎn)生新性狀。關(guān)于遺傳變異的產(chǎn)生的根底是什么？這個問題早在幾百年前就引起了人們的注意：〔1〕直到19世紀，達爾文進化論的發(fā)表，推動了生物學的開展——說明了生物是進化的，但對遺傳變異的規(guī)律、機理并沒有完全了解。〔2〕1866年，孟德爾〔奧地利〕提出別離法那么與自由組合律，他提出遺傳是通過一種“遺傳因子〞來實現(xiàn)的，此理論提出沉睡了35年，到1890年才受到重視?！?〕1901年，摩爾根進一步研究果蠅的遺傳規(guī)律，把“遺傳因子〞開展成“基因〞，即決定遺傳的物質(zhì)根底是染色體上的基因?！?〕1944年，美國學者阿維利〔Avery〕等，通過肺炎球菌的轉(zhuǎn)化實驗，確定遺傳上起支配作用的化學物質(zhì)成分并非是蛋白質(zhì)，而是核酸，特別是DNA?！?〕1952年，侯喜〔Hershey〕和蔡斯(chase)利用同位素示蹤，對大腸桿菌T2噬菌體的感染實驗，證實了DNA是遺傳物質(zhì)的根底。〔6〕1956年，弗朗克康勒脫〔Fraenkel-Conrat〕等，利用植物病毒的拆開和重建實驗，證實了RNA是病毒的遺傳根底。第一節(jié)遺傳變異的物質(zhì)根底

一、3個經(jīng)典的實驗：證明DNA才是一切生物遺傳變異的真正物質(zhì)根底。1經(jīng)典的轉(zhuǎn)化實驗：英國醫(yī)生1928年首次發(fā)現(xiàn)，F(xiàn).Griffith作了以下3組實驗：〔1〕動物實驗：S型菌落屬致病菌；R型菌落是非致病菌。參加活R菌或死S菌小白鼠〔活〕小白鼠〔活〕參加活S菌小白鼠〔死〕參加活R菌和熱死S菌小白鼠〔死〕活的S菌〔2〕細菌培養(yǎng)實驗：熱死S菌培養(yǎng)皿培養(yǎng)不生長肺炎鏈球菌活R菌培養(yǎng)皿培養(yǎng)長出R菌熱死S菌+活R菌培養(yǎng)皿培養(yǎng)長出大量R菌+10-6S菌〔3〕S型菌的無細胞抽提液實驗：活R菌+S菌的無細胞抽提液培養(yǎng)長出大量R菌和少量S菌以上實驗證明了加熱殺死的S型細菌，在細胞內(nèi)可能存在一種具有遺傳轉(zhuǎn)化能力的物質(zhì)，它能通過某種方式進入R型細菌，并使R型細菌獲得表達S型莢膜性狀的遺傳特性。提取證明轉(zhuǎn)化因子〔1〕從活的S型細菌中抽提各種細胞成分〔DNA、蛋白質(zhì)、莢膜多糖〕〔2〕對各種生化組分進行轉(zhuǎn)化實驗加S型菌的DNA長出S型菌加S型菌的DNA和DNA酶以外的酶活R菌加S型菌的DNA和DNA酶加S型菌的RNA加S型菌的蛋白質(zhì)只長R型菌加S型菌的莢膜多糖實驗證明RNA、蛋白質(zhì)、莢膜多糖均不能引起轉(zhuǎn)化，而DNA能引起轉(zhuǎn)化。分別用降解DNA、RNA、蛋白質(zhì)的酶類

作用于有毒的S型菌細胞抽提物二、噬菌體的感染實驗：1952年A.D.Hershey和M.Chase發(fā)表了證實DNA是噬菌體的遺傳物質(zhì)根底的著名實驗——噬菌體感染實驗。

離心吸附沉淀細胞進一步培養(yǎng)后上清液含15%放射性可產(chǎn)生大量完整的子代噬菌體沉淀中含85%放射性用噬菌體的DNA標記上放射性元素32P大腸桿菌、噬菌體的DNA標記上放射性元素32P、噬菌體的蛋白質(zhì)衣殼標記上放射性元素35S用含35S-蛋白質(zhì)外殼的噬菌體作感染實驗：

離心

沉淀細胞進一步培養(yǎng)后，上清液中含75%放射性可產(chǎn)生大量完整的子代噬菌體沉淀中含25%放射性實驗證明了在DNA中，存在著包括合成蛋白質(zhì)外殼在內(nèi)的整套遺傳信息。

噬菌體的感染實驗三、植物病毒的重組實驗：核酸才是遺傳物質(zhì)以上三個實驗證明了只有核酸才是遺傳物質(zhì)的根底。四、遺傳物質(zhì)在微生物細胞內(nèi)存在的部位和方式：〔1〕細胞水平：一些霉菌、放線菌的菌絲是多核，孢子為單核。原核生物的細胞中含有質(zhì)粒，具有獨立復制能力的小型共價閉合環(huán)狀的雙鏈DNA分子?！?〕細胞核：真核生物細胞核DNA+組蛋白形成染色體；原核生物的細胞核的DNA是環(huán)狀雙鏈結(jié)構(gòu)，不與組蛋白結(jié)合。〔3〕染色體水平：不同生物的染色體數(shù)目差異較大。〔4〕核酸水平：大多數(shù)生物的遺傳物質(zhì)是DNA，只有少數(shù)病毒如多數(shù)的植物病毒是RNA，真核生物中DNA總是與組蛋白結(jié)合的；原核生物的DNA是單獨存在的?！?〕基因水平：基因是生物體內(nèi)一切具有自主復制能力的最小遺傳功能單位。眾多的基因構(gòu)成了染色體?！?〕密碼子水平：4個核苷酸可有64種組合，編碼20個氨基酸，UAA、UAG和UGA為終止密碼?！?〕核苷酸水平：A、T、G、C。五、DNA的結(jié)構(gòu)和復制：1DNA的結(jié)構(gòu)：2DNA的復制：半保存、半不連續(xù)復制。質(zhì)粒〔plasmid〕一種獨立于染色體外，能進行自主復制的細胞質(zhì)遺傳因子，主要存在于各種微生物細胞中。第二節(jié)基因突變和誘變育種

1突變的類型：一按突變涉及的范圍，可分為基因突變和染色體畸變。(1)基因突變：指細胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量突然發(fā)生的可遺傳的變化，可自發(fā)或誘導產(chǎn)生?！?〕染色體畸變：廣義的突變包括基因突變和染色體畸變。染色體畸變一般指染色體的數(shù)目不變化，但染色體上有較大范圍結(jié)構(gòu)改變，如DNA〔RNA〕的片段缺失、重復、易位等。發(fā)生在染色體畸變的微生物往往易致死，因此微生物中突變類型的研究主要在基因突變方面。二按突變所致的表型改變，突變劃分為：〔1〕形態(tài)突變型：突變后導致菌體的形態(tài)發(fā)生變化，如細胞形態(tài)、菌落形態(tài)、孢子的顏色等的變化，鞭毛、莢膜的有無，菌落的R型或S型的變化?！?〕致死突變型：指由于基因突變導致個體死亡的突變類型。如導致個體生活力下降稱為半致死突變型。〔3〕條件致死突變型：指微生物基因突變后，在某種條件下可正常地生長、繁殖并表現(xiàn)其固有的表型，而在另一種條件下無法生長繁殖，這種突變類型稱為條件致死突變型?；虻耐蛔儭?〕營養(yǎng)缺陷突變型：某些野生型菌株發(fā)生基因突變而喪失合成一種或幾種生長因子、堿基或氨基酸的能力，因而無法再在根本培養(yǎng)基上正常生長繁殖的變異類型，稱為營養(yǎng)缺陷型?！?〕抗性突變型：某些野生型菌株發(fā)生基因突變，而產(chǎn)生的對某種化學藥物或致死物理因子的抗性變異類型。它們可在加有相應藥物或用相應物理因子處理的培養(yǎng)基平板上選出。抗性突變型普遍存在，例如對一些抗生素具有抗藥性的菌株等?？剐酝蛔冃偷木暝谶z傳學、分子生物學、遺傳育種和遺傳工程等研究中，極其重要?！?〕抗原突變型：指由于基因突變引起的細胞抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生的變異類型，包括細胞壁缺陷變異〔L型細菌等〕、莢膜或鞭毛成分變異等，一般也屬非選擇性突變?！?〕產(chǎn)量突變型：通過基因的突變導致代謝產(chǎn)物產(chǎn)量上與原始菌株有明顯的差異，稱產(chǎn)量突變型。如果產(chǎn)量高于原始菌株，稱正變菌株，相反，稱負變菌株。三按突變的條件和原因分，突變分為自發(fā)突變和誘變?！?〕自發(fā)突變：由于自然界中存在的輻射因素和環(huán)境誘變劑所致。A微生物的代謝產(chǎn)物具有誘變作用：如H2O2、咖啡堿、硫氰化合物、二硫化二丙烯、重氮絲氨酸等等。H2O2對脈孢菌有誘變作用，如果同時參加H2O2酶抑制劑，那么可提高誘變效果，說明H2O2有可能是引起自發(fā)突變的一種內(nèi)源誘變劑。B互變異構(gòu)效應：由于DNA分子中的四種核苷酸分子內(nèi)部稀醇式〔T、G〕和酮式互變；胞嘧啶和腺嘌呤〔C、A〕分子中氨基式和亞氨基式互變；導致復制時錯配，是引起自發(fā)突變的原因。自發(fā)突變的頻率是很低的，一般在10-6-10-10?！?〕誘變的機制：①誘變的機理：誘變劑引起DNA分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生堿基對的置換、移碼突變、染色體畸變等變化。A堿基對的置換：指DNA分子中一對堿基被另一對堿基所置換；或發(fā)生了顛換。一般由化學誘變劑引起。B移碼突變：由于DNA分子中一對或幾對核苷酸的增加或缺失而造成的基因突變。導致翻譯出的蛋白質(zhì)發(fā)生變化。C染色體畸變：DNA分子出現(xiàn)較大損傷的誘變，出現(xiàn)染色體的結(jié)構(gòu)的異位、倒位、缺失、重復等。物理和化學因素均可導致此變化。是在4種酶的協(xié)同作用下進行的將核酸損傷處切開形成單鏈缺口，去除二聚體，合成新的鏈，在連接成完整的鏈?！?〕重組修復作用：即是復制后修復。

解鏈復制后經(jīng)過染色體交換，使子鏈上的空隙部位不再面對二聚體，而是面對正常的鏈，這時DNA聚合酶和連接酶便能起作用，把空隙局部進行修復?！?〕SOS修復：這是在DNA分子受到較大范圍的重大損傷時誘導產(chǎn)生的一種應急反響。SOS修復需要修復基因：recA、lexA、uvrA、uvrB和uvrC。3微生物的突變與育種：〔1〕誘變育種的根本環(huán)節(jié)：〔2〕誘變育種的幾個原那么：艾姆氏實驗檢測食品中“三致〞物質(zhì)的美國加利福尼亞大學的BruceAmes教授于1966年創(chuàng)造，因此稱為Ames試驗

菌種：鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphmurium)組氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株(his-)的回復突變率。的方法和原理：菌種-鼠傷寒沙門氏菌，是組氨酸營養(yǎng)缺陷型，在根本培養(yǎng)基平板上不生長，如果發(fā)生回復突變成原養(yǎng)型后那么能生長。該方法用于檢測食品中的黃曲霉毒素、二甲氨基偶氮苯〔奶油黃〕、二惡英，參加鼠肝勻漿液，保溫一段時間，吸入紙片中將紙片在平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)。-待檢測食品鼠肝勻漿液保溫吸入濾紙片+陽性陰性實驗廣泛用于食品、飲料、藥物、飲水和環(huán)境等樣品中致癌物的檢測，此法的特點：快速、準確、節(jié)約，一般3天出結(jié)果，符合率在85%左右。說明樣品中有大量的誘變劑第三節(jié)微生物基因重組基因重組是在核酸分子水平上的一個概念，是遺傳物質(zhì)在分子水平上的雜交，因此與一般細胞水平上進行的雜交有明顯區(qū)別；細胞水平上的雜交，必然包含了分子水平上的重組，例如真核微生物中的有性雜交、準性雜交、原生質(zhì)體融合以及原核生物中的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導、結(jié)合和原生質(zhì)體融合等。一、原核生物的基因重組：原核生物的基因重組形式很多，機制較原始，特點為：①片段性，僅一小段DNA序列參與重組；②單向性，即從供體菌向受體菌作單方向轉(zhuǎn)移；③轉(zhuǎn)移機制獨特而多樣，如結(jié)合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導和溶源性轉(zhuǎn)變等。1轉(zhuǎn)化：是指受體菌直接吸收供體菌的DNA片段而獲得后者局部遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)化作用。轉(zhuǎn)化后的受體菌叫轉(zhuǎn)化子，供體菌的DNA片段稱為轉(zhuǎn)化因子，通常呈質(zhì)粒狀態(tài)的轉(zhuǎn)化因子轉(zhuǎn)化頻率最高，受體菌只有在感受態(tài)的情況下才能吸收轉(zhuǎn)化因子。供體菌受體菌(轉(zhuǎn)化子)DNA片段(轉(zhuǎn)化因子)

通常呈質(zhì)粒狀態(tài)的轉(zhuǎn)化因子轉(zhuǎn)化頻率最高，受體菌只有在感受態(tài)的情況下才能吸收轉(zhuǎn)化因子。原核微生物的基因轉(zhuǎn)移和重組細菌的三種水平基因轉(zhuǎn)移形式：1接合2轉(zhuǎn)導3自然轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化過程：供體菌基因組〔模板〕，PCR擴增目的基因dsDNA受體菌制成感受態(tài)細胞與質(zhì)粒連接單鏈進入另一條鏈降解同源區(qū)配對重組

雜合子復制原核生物中轉(zhuǎn)化是一種比較普遍的現(xiàn)象，許多細菌、放線菌和藍細菌均可發(fā)生轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。T7ApaⅠAatⅡSphⅠBstZⅠNcoⅠBstZⅠNotⅠSacⅡEcoRⅠSpeⅠEcoRⅠNotⅠBstZⅠPstⅠSalⅠNdeⅠSacⅠBstXⅠNsiⅠSP601start14202631374343495264707777889097109118127141NaeⅠ2707XmnⅠ2009ScaⅠ1890f1orilacZAmprPGEM?-TEasyVector(3015bp)ori圖6－1pGEM－T載體結(jié)構(gòu)Figure6－1.pGEM?-TEasyVectorcirclemapandsequencereferencepoints.微生物的自然遺傳轉(zhuǎn)化-簡稱自然轉(zhuǎn)化1928年，Griffith發(fā)現(xiàn)肺炎鏈球菌〔Streptococcuspneumoniae〕的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象目前已有二十多個種細菌具有自然轉(zhuǎn)化的能力進行自然轉(zhuǎn)化，需要以下必要的條件：1建立感受態(tài)的受體細胞2外源游離DNA分子枯草芽孢桿菌的自然轉(zhuǎn)化過程2轉(zhuǎn)導：是以噬菌體為媒介，把一個菌株的遺傳物質(zhì)〔小片段DNA〕導入另一個菌株，并使這個菌株獲得另一個菌株的遺傳性狀。轉(zhuǎn)導由分為普遍性轉(zhuǎn)導和特異性轉(zhuǎn)導。普遍性轉(zhuǎn)導：指轉(zhuǎn)導型噬菌體能傳遞供體菌株任何基因。特異性轉(zhuǎn)導：指噬菌體只能轉(zhuǎn)導供體染色體上某些特定的基因。3接合：是通過供體菌和受體菌的直接接觸傳遞遺傳物質(zhì)。接合有時稱為雜交。接合不僅存在于大腸桿菌中，其它細菌中也存在。例如大腸桿菌的接合與細菌外表的性纖毛有關(guān)，F(xiàn)因子是接合的關(guān)鍵，F(xiàn)因子又叫致育因子，是一種質(zhì)粒。根據(jù)F質(zhì)粒在細胞內(nèi)的存在方式的不同，大腸桿菌有3種不同接合型菌株：〔1〕F+XF-：F+雄性菌株，細胞內(nèi)存在質(zhì)粒F-雌性菌株，細胞內(nèi)無質(zhì)粒F+質(zhì)粒進入轉(zhuǎn)入F-菌株中兩者都成為F+菌，轉(zhuǎn)性別頻率近100%F+♂F-♀局限性的轉(zhuǎn)導溶源菌因誘導而發(fā)生裂解時，在前噬菌體二側(cè)的少數(shù)宿主基因因偶爾發(fā)生的不正常切割而連在噬菌體DNA上；把供體菌的少數(shù)特定基因轉(zhuǎn)移到受體菌中普遍性的轉(zhuǎn)導形成轉(zhuǎn)導顆粒的噬菌體可是溫和的；也可是烈性的，但必須具有能偶爾識別宿主DNA的裝配機理，并在宿主基因組完全降解以前進行裝配。鼠傷寒沙門氏菌的普遍性轉(zhuǎn)導

〔2〕F’×F-：F’游離的、但攜帶整合位點鄰近小段核染色體基因的特殊F質(zhì)粒也成為F’菌株，以F’質(zhì)粒來傳遞供體基因的方式，稱為F質(zhì)粒轉(zhuǎn)導〔3〕Hfr菌株(高頻重組菌株highfreguencyrecombinationstrain)Hfr菌株，F(xiàn)質(zhì)粒整合在核染色體特定部位，接合時斷裂成線狀片段DNA通過性菌毛轉(zhuǎn)移到F-

接合后，基因重組頻率非常高F-♀F’♂F-♀細菌的結(jié)合是通過細胞與細胞的直接接觸產(chǎn)生的遺傳信息的轉(zhuǎn)移和重組過程；在1946年，JoshuaLederberg和EdwardL.Taturm細菌的多重營養(yǎng)缺陷型雜交實驗證實4溶源性轉(zhuǎn)變：溫和噬菌體感染其宿主發(fā)生溶源化時，因噬菌體基因整合到宿主的核基因組上，而使宿主獲得了除免疫外的新遺傳性狀的現(xiàn)象，稱溶源轉(zhuǎn)變。外表上與轉(zhuǎn)導相似，但是與轉(zhuǎn)導有本質(zhì)的不同。溶源性轉(zhuǎn)變的特點：①這是一種不攜帶任何外源基因的普通噬菌體；②由噬菌體的基因而不是供體菌的基因提供的宿主新性狀；③新性狀是宿主細胞溶源化時的表型，而不是經(jīng)遺傳重組形成的穩(wěn)定轉(zhuǎn)導子；④獲得的性狀可隨噬菌體的消失而同時消失；噬菌體的基因重組：溫和性噬菌體——烈性噬菌體——總結(jié)自然遺傳轉(zhuǎn)化(naturalgenetictransformation)——需要游離DNA分子片段+感受態(tài)細胞；轉(zhuǎn)導(transduction)——由噬菌體介導；接合(conjugation)——細胞與細胞的直接接觸〔由F因子介導〕；酵母菌的有性雜交酵母菌的生活史既包括二倍體、單倍體世代，又包括有性和無性世代。二倍體單倍體霉菌的繁殖霉菌的基因重組可通過有性生殖或準性生殖過程來完成。準性生殖是指不經(jīng)過減數(shù)分裂就能導致基因重組的生殖過程異核體的形成、二倍體的形成以及體細胞交換和單倍體化真核微生物的有性雜交霉菌的有性繁殖——有性孢子繁殖1、質(zhì)配：兩個性細胞發(fā)生結(jié)合，細胞質(zhì)融合，成為雙核細胞，每個核均含單倍染色體〔n+n〕。2、核配：兩個核融合，成為二倍體接合子核，此時核的染色體數(shù)是二倍〔2n〕。3、減數(shù)分裂：具有雙倍體的細胞核經(jīng)過減數(shù)分裂，核中的染色體數(shù)目又恢復到單倍體狀態(tài)。霉菌的準性雜交準性雜交與有性雜交的比照第四節(jié)菌種的保藏及衰退與復壯要選育一株符合生產(chǎn)上要求的菌株并非容易，而要使菌種在生產(chǎn)上長期保持優(yōu)良性狀更難，為此，要做許多工作使菌種不死、不衰、不污染。但要使菌種永遠不變是不可能的，由于菌種存在著自發(fā)性的低頻率變異，以及各種誘變因素的作用，菌種退化是一種潛在的威脅，為了延緩菌種的變異，人類研究保藏菌種的方法，許多國家設(shè)立了菌種保藏機構(gòu)。菌種保藏的目的目的：

①延續(xù)物種，不喪失，不污染

②防止優(yōu)良性狀退化

③為生產(chǎn)、科學研究提供優(yōu)良性狀菌種

1菌種保藏的機理：無論哪種保藏方法，主要是使微生物處于不活潑的休眠狀態(tài)，因此要求低溫、枯燥、缺氧條件，在這樣環(huán)境中菌種很少發(fā)生突變到達純種的目的。2微生物菌種保藏的方法〔1〕斜面保藏法：〔2〕半固體保藏法：〔3〕礦物油保藏法：〔4〕枯燥載體保藏法〔沙土管保藏法〕：〔5〕真空冷凍保藏法：〔6〕冷凍保藏法：〔7〕國外菌種保藏機構(gòu)：菌種保藏的方法菌連續(xù)在培養(yǎng)基上〔內(nèi)〕移種種生活態(tài)傳代培養(yǎng)保藏法連續(xù)在活宿主上〔內(nèi)〕移種保固體斜面藏濕法半固體瓊脂柱方休眠態(tài)液體介質(zhì)〔蒸餾水、糖液、其它溶液〕法干法藏在玻璃管內(nèi)吸附在適宜的載體上表5-常用菌種保藏方法的比較方法保藏機理適用范圍保藏時間特點半固體保藏法斜面保藏法礦物油保藏法沙土管保藏法真空凍干保藏法超冷凍保藏法液氮保藏法低溫、（4℃）缺氧低溫（4℃）低溫（4℃）、阻氧干燥、無營養(yǎng)干燥、無氧、低溫（-90℃）、有保護劑超低溫（-70℃~-80℃）20%甘油、10%的二甲基亞砜超低溫（-196℃）、有保護劑細菌、酵母菌各大類各大類（不能利用石油）產(chǎn)孢子的微生物各大類各大類各大類約6-12月約1-6月約1-2年約1-10年﹥5-10年5年﹥15年方法簡單方法簡單方法簡單方法簡單煩瑣高效煩瑣高效煩瑣高效斜面接種無菌操作程序

半固體穿刺接種方法沙土管保藏法選中等細度沙清洗酸洗中性烘干滅菌加微生物孢子枯燥封瓶口

真空凍干保藏法高密度細胞培養(yǎng)離心洗滌加保護劑真空冷凍枯燥包裝封口超低溫冷凍保藏法超低溫〔-70℃~-80℃〕20%甘油、10%的二甲基亞砜高密度細胞培養(yǎng)離心洗滌加保護劑分裝封口真空超低溫冷凍生產(chǎn)上的其他保藏方法曲料枯燥保藏法：取麩皮或米糠加水滅菌后，接種菌種，培養(yǎng)枯燥后保藏。凍結(jié)保藏法：生長在斜面上的菌株或液體培養(yǎng)液，參加保護劑后直接冷凍，保藏溫度越低越好。該法用于放線菌的保藏較好。生產(chǎn)種曲-醪糟菌種傳代過程中應注意的關(guān)鍵問題菌種的遺傳變異；發(fā)生菌種的編號、菌名稱等事故；產(chǎn)酸菌種傳代時培養(yǎng)基中參加碳酸鈣可取得良好的保藏效果；防止菌種污染；棉塞的處理方法斜面培養(yǎng)基的斜面不能太高；微生物在培養(yǎng)基中生長時：用10滴40%的甲醛溶液滴加在棉塞上端，微生物完全生長好后，用液體石蠟封口，可防止污染；將消毒劑對二氯苯或殺蟲劑加在棉塞的底部國內(nèi)外菌種保藏機構(gòu)ATCC美國菌種保藏機構(gòu)IFO日本大板發(fā)酵研究所JAM東京大學應用微生物研究所NCTC英國國家典型菌種保藏所CBS荷蘭真菌中心保藏所IPL法國里昂巴斯德研究所RKI德國科赫研究所DSM德國菌種保藏中心CCCCM中國微生物菌種保藏管理委員會CMI英聯(lián)邦真菌研究所中國微生物菌種保藏管理委員會CCGMC普通微生物菌種保藏管理委員會〔北京〕AS-IV中國科學院武漢病毒研究所〔武漢〕ACCC農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心〔北京〕CICC工業(yè)微生物菌種保藏管理中心〔北京〕IFFI中國食品發(fā)酵工業(yè)科學研究所〔北京〕CMCC醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心〔北京〕ID中國醫(yī)學科學院皮膚病研究所〔南京〕NICPBP衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所〔北京〕CACC抗生素菌種保藏管理中心〔北京〕CACC四川抗生素工業(yè)研究所〔成都〕IANP華北制藥廠抗生素研究所〔石家莊〕CVCC獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心〔北京〕CIVBP農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)藥品檢察所〔北京〕國內(nèi)外菌種保藏方法國外的保藏方法：真空冷凍保藏法〔5-15年〕和液氮保藏法〔20年〕。

當年10年15年20年25年分發(fā)用液氮保藏〔原種〕2菌種的衰退與復壯：在生物進化的長河中，遺傳性的變異是絕對的，而它的穩(wěn)定性那么是相對的；退化性的變異是大量的，而進化性的變異是個別的。在自然的條件下，個別的適應性變異通過自然選擇就可保存和開展，最后成為進化的方向；在人為條件下，人們也可通過人工選擇法有意識地篩選出個別的正變體，并用于生產(chǎn)中。如果不進行人工選擇，不進行純化、復壯和育種，大量的自發(fā)突變菌株就會隨之泛濫，導致菌種的優(yōu)良性狀衰退，生產(chǎn)上出現(xiàn)生長慢、代謝產(chǎn)物產(chǎn)量低等?！?〕衰退的表現(xiàn)：①生長緩慢：生長的速度下降，到達對數(shù)期在平板上看不到菌落，或菌落小，液體培養(yǎng)渾濁度低；②原有的形態(tài)發(fā)生變化，不典型；③代謝產(chǎn)物的能力下降；④抗不良環(huán)境的能力下降：如高溫、低溫、噬菌體；⑤侵染力下降：〔2〕衰退的防止：平板外表涂布法菌落純平板劃線別離法純種別離法瓊脂培養(yǎng)基混菌法用“別離小室〞進行單細胞別離細胞純用顯微操縱器進行單細胞別離用菌絲尖刀切割法進行進行單細胞別離②通過宿主體復壯：③淘汰已衰退的個體：采用不良的條件處理微生物，如低溫、高溫等5-7天，使微生物80%發(fā)生死亡，然后挑選出沒有死亡而保持優(yōu)良性狀的個體到達復壯。測驗一名稱解釋：轉(zhuǎn)化有性雜交轉(zhuǎn)導質(zhì)粒表型二填空1.基因點突變包括——、——、——。2.光復活作用————。三問答題1.表達艾姆氏〔Ames〕實驗方法檢測食品中致癌物的方法原理。第七章微生物的生態(tài)第一節(jié)微生物在自然界中的分布與菌種資源的開發(fā)第二節(jié)微生物與生物環(huán)境間的關(guān)系第三節(jié)微生物在生態(tài)中的作用第四節(jié)微生物與環(huán)境保護微生物生態(tài)學〔microorganismecology〕：是研究微生物群體―微生物區(qū)系〔microflora〕或菌群〔normalflora〕對其周圍的生物和非生物環(huán)境條件相互作用關(guān)系的科學。各種環(huán)境中的微生物的種類、分布；微生物和其它生物的關(guān)系；微生物與物質(zhì)循環(huán)；微生物與污染的治理分子水平亞細胞水平細胞水平個體水平種群水平群落水平生態(tài)系統(tǒng)生物圈研究生態(tài)學的意義生態(tài)學研究范圍：生物圈〔biosphere〕、生態(tài)系統(tǒng)〔ecosystem〕、群落〔community〕、種群〔population〕。研究意義：1、在理論方面的意義：研究微生物與生物圈的關(guān)系2、在實踐方面的意義：為生態(tài)環(huán)境中的菌種資源開發(fā)、有害微生物的防治、微生物農(nóng)藥的開發(fā)、菌肥的開發(fā)提高土壤肥力、食品工業(yè)中的混菌發(fā)酵、生態(tài)農(nóng)業(yè)，工業(yè)中探礦、冶金、環(huán)保、以及開發(fā)生物能等。概念生物圈：是指地球上的所有生物的總稱。生態(tài)系統(tǒng)：生物群落與其環(huán)境相互結(jié)合、相互作用、相調(diào)控而成的動態(tài)系統(tǒng)叫生態(tài)系統(tǒng)。群落：相同生長環(huán)境中兩個以上種群的生物由于生活繁殖上的連鎖而構(gòu)成相互依賴、相互制約的生態(tài)學功能單位叫群落。種群：相同生長環(huán)境中的同種個體組成的能繁殖的同種個體群，是組成群落的根本組分，與同種其他地方的種群有隔離、有界限。微生物生態(tài)學—是生態(tài)學的一個分支，它的研究對象是微生物群體與其周圍生物和非生物環(huán)境條件間相互作用規(guī)律的科學。教學目標:要求同學們掌握微生物的分布規(guī)律科學有利于開掘菌種資源；有利于食品工業(yè)中有目的地控制食品平安性；重點掌握微生物與他種生物間的相互關(guān)系〔互生、共生、拮抗、寄生〕，并為食品工業(yè)中開展混菌發(fā)酵，生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)美味食品做奉獻；了解微生物在生態(tài)中作用，為農(nóng)業(yè)以及動物、植物病蟲害的防止提供理論依據(jù)；了解微生物在治理環(huán)境污染、促進大自然的生態(tài)平衡的作用；

第一節(jié)微生物在自然界中的分布與

菌種資源的開發(fā)土壤中的微生物水中的微生物空氣中的微生物生物體帶的微生物極端環(huán)境中的微生物工農(nóng)業(yè)產(chǎn)品中的微生物目前未能培養(yǎng)的微生物微生物的特點：個體微小、代謝營養(yǎng)類型多樣，適應能力強微生物在自然界中分布廣泛微生物的分布生態(tài)環(huán)境的特征微生物的分布是生態(tài)環(huán)境各種物理、化學、生物因素對微生物的限制、選擇的結(jié)果。一、土壤中的微生物堿度、滲透壓和溫度等條件，所以成了微生物生活的良好環(huán)境。土壤是微生物的“大本營〞，是豐富的菌種資源庫。土壤中微生物的數(shù)量和種類較多，每克土壤含菌量有一個大致的規(guī)律：土壤中微生物的數(shù)量：按種類遞減細菌——放線菌——霉菌——酵母菌——藻類——原生動物~108 ~107 ~106 ~105 ~104 ~103個/g細菌〔~108〕>放線菌〔~107孢子〕>霉菌〔~106孢子〕>酵母菌〔~105〕>藻類〔~104〕>原生動物〔~103〕耕作土壤中，細菌濕重約90~225kg；以土壤有機質(zhì)含量為2%計算，那么所含細菌干重約為土壤有機質(zhì)的1%左右。土壤微生物的代謝活動，可改變土壤的理化性質(zhì)，進行物質(zhì)轉(zhuǎn)化，因此，土壤微生物是構(gòu)成土壤肥力的重要因素。假設(shè)按生物量計算那么各種微生物的生物量根本相當。規(guī)律：土壤中微生物的含量與土壤有機質(zhì)含量有直接關(guān)系。1.表層耕作土中含量最高，耕作層厚度20~30cm，地表土受陽光直接照射，其中微生物含量較低。2.采取土樣時一般要刮開表土2~5cm后采樣。GAP、GMP、HACCP、ISO、QS等二、水體中的微生物地面水清潔度低地下水清潔度高特殊水極不清潔〔1〕地面水：地面水的含菌量與土壤密切相關(guān)，含菌量比地下水多，有細菌、病毒、真菌、藻類、鉤端螺旋體、原蟲。細菌的種類幾乎涉及所有的綱目。清水中化能自養(yǎng)微生物為主，如硫細菌、鐵細菌和含光合色素的藍細菌、綠硫細菌和紫細菌等，如水體中含有生活污水，以腐生型的微生物較多，如變形桿菌屬、產(chǎn)氣腸桿菌、產(chǎn)堿桿菌屬、芽孢桿菌屬、弧菌屬、螺菌屬等，同時有致病菌如志賀氏菌屬、大腸埃希菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、結(jié)核桿菌、空腸彎曲桿菌、鉤端螺旋體等。〔2〕地下水：地下水由于土壤的過濾作用，營養(yǎng)成分相對較少，細菌比地面水少，主要是G-的無芽孢桿菌，特別是無色桿菌和黃桿菌屬，少數(shù)G+桿菌、微球菌、棒狀桿菌、分枝桿菌等?！?〕高溫的溫泉：泉水中含有鐵細菌，高溫的溫泉分布有耐熱的微生物。〔4〕特殊水體中：如醫(yī)院污水、實驗室污水，尤其是沒有污水處理的小的醫(yī)院，在污水中別離到傷寒、副傷寒、其他沙門氏菌、霍亂弧菌、痢疾桿菌等?！?〕海水：含鹽量：3.5%，密度大、滲透壓高、冰點低微生物種類：多數(shù)為革蘭氏陰性菌、多嗜鹽、河口處有耐鹽菌，嗜鹽菌：低嗜鹽菌，適于生活在鹽濃度2～5%； 中等嗜鹽菌，適于生活在鹽濃度5～20%； 高嗜鹽菌：適于生活在鹽濃度20～30%形態(tài)：多有鞭毛，常見多形性、可變?yōu)榍蛐?、弧形、絲狀及螺旋狀，個體小；生理：多嗜冷，兼性厭氧，生長慢，能在低營養(yǎng)下生活，常產(chǎn)色素，分解蛋白質(zhì)能力強，對糖的分解能力低，多嗜冷，對熱敏感；分布：不均勻，與水深成反比， 0~10米——少 10~50米——呈上升變化 50米以下數(shù)量減少常見菌種：假單孢菌、弧菌、螺菌、無色桿菌、黃桿菌

〔6〕生活飲用水的衛(wèi)生學指標：〔A〕細菌總數(shù)：<100個/ml，反響出水的污染程度，細菌總數(shù)越多，說明水中的有機物及其分解產(chǎn)物含量越多。10~100為最清潔水；100~1000為清潔水；1000~10000不太清潔水；10000~100000不清潔水；>100000的為極不清潔水。(B)大腸菌群：<3個/立升水對食品的污染：水污染食品原料；污染食品加工的機械設(shè)備；水的衛(wèi)生程度直接關(guān)系到食品的平安性。水的富營養(yǎng)化藻類等過量生長，產(chǎn)生大量的有機物異養(yǎng)微生物氧化這些有機物，耗盡水中的氧，使厭氧菌開始大量生長和代謝分解含硫化合物，產(chǎn)生H2S，從而導致水有難聞的氣味，魚和好氧微生物大量死亡，水體出現(xiàn)大量沉淀物和異常顏色水體的富營養(yǎng)化作用和“水花〞、“赤潮〞上述過程又稱富營養(yǎng)化作用，它是水體受到污染并使水體自身的正常生態(tài)失去平衡的結(jié)果?！八è暬颉八A〞〔waterbloom〕：藻類〔主要是微藻〕的大量繁殖使水體出現(xiàn)顏色，并變得渾濁，許多藻類團塊漂浮在水面上形成。赤潮或紅潮〔redtides〕

在海洋中，某些甲藻類大量繁殖也可也可以形成水花，從而使海水出現(xiàn)紅色或褐色。引起水體富營養(yǎng)化的藻類除通過消耗水中的氧氣危害養(yǎng)殖業(yè)外，很多藻類還能產(chǎn)生各種毒素，使動物得病或死亡，因此由于富營養(yǎng)化作用致死的魚等水產(chǎn)品不能食用三、空氣中的微生物空氣的自然條件：無營養(yǎng)和水分、紫外線直射1微生物存在方式：漂浮，短暫停留，吸附在塵埃微粒上。空氣中的塵埃顆粒數(shù)量與微生物數(shù)量呈正相關(guān)。2分布：接近越地面空氣中含菌量越高，目前能夠檢測到微生物存在最高處為85km的空間高度。3種類：細菌、真菌孢子、微球菌、產(chǎn)芽孢和不產(chǎn)芽孢的G+桿菌、G+球菌和G-桿菌；真菌中主要是芽枝霉菌、交鏈孢霉屬、出芽茁霉屬、青霉屬、曲霉屬、葡萄孢霉屬等，同時含有病毒。4空氣中微生物數(shù)量的測定方法：培養(yǎng)皿沉降法、液體阻留法5空氣中的微生物除去方法：紫外線照射、甲醛熏蒸、藥物噴霧、過濾除菌等，常用的過濾介質(zhì)有棉花、紗布、石棉濾板、活性炭或超細玻璃纖維過濾紙等。〔1〕在森林、高山、高空、海洋和終年積雪地帶的上空：微生物的數(shù)量少；〔2〕在城市中心、醫(yī)院、車站、碼頭等人口流動大的地方上空：微生物的數(shù)量多?！?〕空氣中微生物的檢測方法：沉降平板法。食品加工廠建廠原那么：要遠離鬧市區(qū)，垃圾處理場、化工廠、廁所。四、食品工業(yè)的原料上的微生物糧食、水果、蔬菜：各種農(nóng)產(chǎn)品上存在著大量的微生物，由此引起霉腐，嚴重的致病〔真菌毒素〕黃曲霉素、伏馬菌素等。每年全球糧食因霉腐爛的達總產(chǎn)量的2%。鮮乳原料：有細菌、酵母和霉菌，以細菌，如乳酸菌、丁酸菌、丙酸桿菌、大腸桿菌、甚至致病菌等。鮮肉：也帶有微生物，如假單胞菌、產(chǎn)堿桿菌、黃桿菌、無色桿菌等。鮮蛋：鮮蛋內(nèi)根本上是無菌的，極少數(shù)細菌和病毒可以侵入卵內(nèi)，蛋殼外有大量的菌。五、生物體內(nèi)外的微生物鼠類、蟑螂、昆蟲：帶有大量的微生物，甚至帶有致病菌、腐敗菌；人體內(nèi)外均有各種微生物：皮膚、口腔、鼻腔、消化道等存在大量的微生物，因此要注意在食品加工環(huán)節(jié)防止污染；健康牛的乳房存在的微生物很少，疾病期間帶菌多；如葡萄球菌和大腸桿菌等。六、極端環(huán)境中的微生物1、嗜熱微生物2、嗜冷微生物3、嗜酸微生物4、嗜堿微生物5、嗜鹽微生物6、嗜壓微生物未能培養(yǎng)的微生物未能培養(yǎng)微生物研究的目的意義1了解生物基因多態(tài)性和系統(tǒng)發(fā)生的多樣性；2尋找新的有益微生物；3從不可培養(yǎng)微生物中尋找新的基因據(jù)報道，美國recombianantbiocatalysisInc公司目前已從不可培養(yǎng)微生物中獲得了約300個與工業(yè)生產(chǎn)相關(guān)的新蛋白第二節(jié)微生物與生物環(huán)境的關(guān)系一互生—兩種可單獨生活的生物，當他們在一起時，各自的代謝活動有利于對方，或偏利于一方的生活方式，稱為互生〔metabiosis〕。1微生物間的互生關(guān)系：〔1〕保加利亞乳桿菌和嗜熱乳鏈球菌二者為良好的互生關(guān)系：保加利亞乳桿菌乳蛋白纈氨酸、甘氨酸、組氨酸嗜熱乳鏈球菌生長甲酸〔保加利亞乳桿菌〕土壤中好氧性自生固氮菌與纖維素分解菌生活在一起時，纖維素分解菌降解纖維素產(chǎn)生有機酸，可為自生固氮菌提供營養(yǎng)，自生固氮菌為纖維素分解菌提供氮素營養(yǎng)。〔2〕需氧菌和厭氧菌的互生關(guān)系：〔3〕互生現(xiàn)象與發(fā)酵工業(yè)中的混菌發(fā)酵：2微生物與人體的互生關(guān)系：微生態(tài)制劑——含有益菌的活菌制劑，功能是維持宿主的微生態(tài)平衡、調(diào)整宿主的微生態(tài)失調(diào)，并有保健功能，又叫益生菌劑。固體：乳酶生、媽米愛、菲爾康等。液體：含嗜酸乳酸菌、雙歧桿菌、短乳桿菌、羅伊氏乳桿菌等。金黃色葡萄球菌的生長為本來在平板上不能生長的嗜血

流感菌提供生長因子，后者在其菌苔周圍形成衛(wèi)星菌落。二共生〔symbiosis〕：是指兩種生物共居在一起，相互分工合作，互相依賴、互相有利，單獨難以生存，有生理整體的形成，這種方式稱為共生。1微生物間的共生關(guān)系：菌藻共生——子囊菌與綠藻共生形成的地衣。菌菌共生——真菌與藍細菌共生。真菌產(chǎn)生有機酸分解巖石，為藻類或藍細菌提供礦質(zhì)元素。2微生物與植物間的共生關(guān)系：〔1〕根瘤菌與植物的共生：如根瘤菌與豆科植物、非豆科植物〔楊梅屬、美洲茶屬等〕和與放線菌共生等?！?〕菌根菌與植物的共生：3微生物與動物的共生：在白蟻、蟑螂等昆蟲腸道中有大量的微生物的共生關(guān)系形成有固定形態(tài)的葉狀結(jié)構(gòu)：真菌無規(guī)那么地纏繞藻類細胞，或二者組成一定的層次排列。和真菌菌絲，粉芽脫離母體散布到適宜的環(huán)境中，發(fā)育成新的地衣共生菌從基質(zhì)中吸收水分和無機養(yǎng)料；共生藻進行光合作用，合成有機物；真菌與藻類的共生2006年攝于哈爾濱五大連池真菌與藻類共生2006年攝于哈爾濱五大連池微生物與植物的共生關(guān)系豆科植物根部的分泌物能刺激根瘤菌的生長，同時，還為根瘤菌提供營養(yǎng)條件。根瘤菌固定空氣中的分子態(tài)氮為植物提供氮素營養(yǎng)；的細菌和原生動物共生，白蟻中至少有100種細菌與其共生，他們在厭氧的條件下分解纖維素供白蟻營養(yǎng)，而微生物那么可獲得穩(wěn)定的生活條件。瘤胃微生物與反芻動物的共生關(guān)系：牛、羊、駱駝、鹿等反芻動物，它們的胃都由4局部組成〔瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃〕，通過與微生物共生它們才能消化纖維素，反芻動物為微生物提供纖維素和無機鹽等養(yǎng)料、水分、適宜的溫度和酸堿度和厭氧環(huán)境，而微生物那么協(xié)助消化纖維素成有機酸供瘤胃吸收。三拮抗：指某種微生物在生命活動的過程中，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可抑制他種生物的生長發(fā)育甚至殺死它們的一種相互關(guān)系叫拮抗。根據(jù)拮抗有無選擇性分：特異性拮抗：拮抗非特異性拮抗：在研究微生物是否具有拮抗關(guān)系的方法——將該兩種或幾種微生物在平板上培養(yǎng)，或在液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察菌落生長情況，可計數(shù)，測定單獨生長的生長曲線和混合生長的生長曲線，比較可得出結(jié)論四寄生：指一種生物必須從另一種生物中獲得營養(yǎng)物質(zhì)，并對后者有毒害作用，稱為寄生。1微生物間的寄生：典型的寄生關(guān)系是噬菌體，也有細菌寄生在真菌引起菌絲溶解的。2微生物與植物間的寄生：寄生在植物中微生物以真菌和病毒居多，細菌相對較少。3微生物與動物間的寄生：微生物殺蟲劑〔蘇云金桿菌〕、生物農(nóng)藥的開發(fā)。蟲草屬[Cordyceps(Fr.)Link]真菌是一大類昆蟲病原真菌，迄今記載的已有300多種，在我國分布有70多種。我國主