紅霉素發(fā)酵進展

紅霉素發(fā)酵進展

紅霉素發(fā)酵水平影響因素紅霉素發(fā)酵水平主要受工作菌種、培養(yǎng)基組成、發(fā)酵條件控制以及后期的分離提純條件等多方面因素的影響。國內(nèi)很多科技工作者從紅霉素發(fā)酵相關(guān)參數(shù)和調(diào)控入手，希望提高紅霉素發(fā)酵水平。菌種：菌種的選育菌種選育是一門應(yīng)用科學技術(shù)，其理論基礎(chǔ)是微生物遺傳學、生物化學等，而其研究目的是微生物產(chǎn)品的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)和發(fā)展新品種為生產(chǎn)不斷地提供優(yōu)良菌種，從而促進生產(chǎn)發(fā)展。1、菌種：菌種的選育目前菌種選育常采用自然選育和誘變育種等方法，帶有一定的盲目性，尚屬于經(jīng)典育種的范疇。隨著微生物學、生化遺傳學的發(fā)展，出現(xiàn)了轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、原生質(zhì)體融合、代謝調(diào)控和基因工程等較為定向的育種方法。例:論文《紅霉素高產(chǎn)菌株的選育》以紅霉素鏈霉菌01126為出發(fā)菌株,經(jīng)LiCl和紫外線復(fù)合誘變處理,再用含有4種不同結(jié)構(gòu)類似物的培養(yǎng)基定向篩選,獲得4株突變株,其中M0359搖瓶效價6876u/ml,比起始菌株(5328u/ml)提高29%,在10t發(fā)酵罐上連續(xù)6批驗證,平均發(fā)酵效價7016u/ml,比原生產(chǎn)水平(5652u/ml)提高24%,并且質(zhì)檢全部合格,對生產(chǎn)實際具有重要意義。例:論文《紅霉素鏈霉菌抗噬菌體菌株的選育》

以紅霉素鏈霉菌B-27為出發(fā)菌株,采用經(jīng)過紫外誘變過的孢子懸浮液與噬菌體接觸的方法進行處理。結(jié)果篩選到一株抗噬菌體高產(chǎn)菌株。通過噬菌體的侵染試驗和搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)能力驗證,其抗噬菌體能力十分穩(wěn)定,紅霉素發(fā)酵搖瓶效價比對照有所提高。該菌株經(jīng)純化后投入生產(chǎn),有效地控制和預(yù)防了噬菌體的污染。菌種選育方向現(xiàn)狀：以提高其產(chǎn)生菌種發(fā)酵單位為目的的遺傳育種工作一直未曾停止。由于對微生物次級代謝產(chǎn)物生物合成的機制了解不多，常規(guī)誘變選育的方法存在周期長、效率低和隨機性大的缺點，近年來在紅霉素高產(chǎn)菌株的篩選方面收效不大。隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，國際上在紅霉素產(chǎn)生菌種的基因工程改造方面進行了諸多嘗試；然而，這些研究主要集中在與紅霉素產(chǎn)生相關(guān)的底物供應(yīng)或限制因素的改進方面，并未就紅霉素生物合成的次生代謝途徑做特異性的遺傳修飾，因此，在解決紅霉素生產(chǎn)中經(jīng)常面臨的有效組分偏低等問題時，缺乏有效的針對性。菌種選育方向作為中科院“百人計劃”、國家杰出青年基金獲得者，自2007年以來，劉文帶領(lǐng)課題組以包括紅霉素、阿維菌素、林可霉素、泰樂菌素和螺旋霉素等大宗抗生素產(chǎn)品為對象，就我國抗生素原料藥產(chǎn)業(yè)普遍存在的問題進行了分析，提出了以組分優(yōu)化為切入點、采用遺傳操作來控制體內(nèi)合成的化學反應(yīng)，從而改善產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量的研究思路。菌種選育方向基于紅霉素各組分結(jié)構(gòu)的差異和相互轉(zhuǎn)化的化學本質(zhì)，他們運用組合生物合成技術(shù)的方法和原理對紅霉素工業(yè)用高產(chǎn)菌株進行了針對性的遺傳改良。通過發(fā)酵過程中后修飾酶的表達比例調(diào)整，他們將無效副產(chǎn)物組分B和C幾乎完全轉(zhuǎn)化為有效組分紅霉素A，從而在提高了產(chǎn)品質(zhì)量(基本消除主要的副產(chǎn)物)的同時，有效地提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量達25%左右。菌種選育方向抗生素在微生物體內(nèi)的合成其本質(zhì)是化學問題，化學過程和機制的解析可以使生物學技術(shù)的運用找到合適的目標并發(fā)揮更大作用。”劉文表示，“以上是我們構(gòu)建的第一代紅霉素生產(chǎn)重組菌株，主要側(cè)重于品質(zhì)(組分優(yōu)化)的提升。目前我們側(cè)重于產(chǎn)量提高的第二代重組菌株已完成中試，結(jié)合前兩代優(yōu)勢、綜合提高質(zhì)量和產(chǎn)量的第三代重組菌株完成了小試，初步數(shù)據(jù)表明效果明顯?！?、培養(yǎng)基：培養(yǎng)基優(yōu)化培養(yǎng)基作為微生物養(yǎng)料的直接來源，是影響微生物生命和生理代謝活動的最主要的因素。發(fā)酵培養(yǎng)基的要求條件就比較多，要實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)就要考慮到原料的因地制宜，價格低廉，資源豐富，便于采購運輸，適合大規(guī)模貯藏，能保證生產(chǎn)上的供應(yīng)。還要考慮到發(fā)酵后的副產(chǎn)物要盡可能的少，而且，所選用的培養(yǎng)基應(yīng)能滿足整體工藝的要求，如不影響通氣、提取、純化及廢物處理等等。因此要獲得高產(chǎn)量的紅霉素，我們要盡可能找到一個最適合其菌種生長的培養(yǎng)基，這包括培養(yǎng)基成分和各組分含量的配比等確定，即對培養(yǎng)基進行優(yōu)化。目前，響應(yīng)面法和正交試驗法是微生物發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化常用的方法?！队衩追鬯馕镒鳛榧t霉素發(fā)酵培養(yǎng)基的研究》

試驗結(jié)果：玉米粉水解物為碳源的發(fā)酵單位和發(fā)酵指數(shù)分別比葡萄糖作碳源提高5.8%和19.0%。玉米粉水解物可同時顯著改善發(fā)酵液的物理性質(zhì),增加裝料系數(shù)和放罐體積。按目前玉米粉、葡萄糖、成品的市場價格計算原料成本降低21%，綜合生產(chǎn)成本26%?！渡锏卦诩t霉素發(fā)酵中的應(yīng)用研究》生物氮素替代部分黃豆餅粉,從搖瓶試驗結(jié)果看對發(fā)酵水平?jīng)]有不良影響,合適的替代比例能提高發(fā)酵水平;從大生產(chǎn)使用的情況看,使用生物氮素的罐批很少出現(xiàn)提前化稀,放罐時發(fā)酵液粘度明顯增大,不但有利于發(fā)酵的工藝控制和發(fā)酵單位的提高、穩(wěn)定,而且發(fā)酵液的預(yù)處理也十分有利。此外,其價格相對黃豆餅粉較低,使用量少。因此,生物氮素的應(yīng)用在提高紅霉素發(fā)酵水平、降低原材料成本方面是具有潛力的,有良好的推廣應(yīng)用價值。3、發(fā)酵條件控制(1)通氣和攪拌：發(fā)酵罐的通氣量一般為1.08一1．2v／(V·min)，增大空氣流量和加快攪拌轉(zhuǎn)速會提高發(fā)酵單位，但必須加強補料的工藝控制，防止菌絲早衰自溶。(2)溫度：采用全程31℃培養(yǎng)，紅色鏈霉菌對溫度較敏感，若前期33℃培養(yǎng)，則菌絲生長繁殖速度加快，粘度峰值出現(xiàn)時間早，但衰老自溶亦快。31℃培養(yǎng)菌絲生長雖比33℃慢，粘度峰值出現(xiàn)時間推遲，但衰老較慢，使粘度下降速度減緩，轉(zhuǎn)稀時間推遲?？刂茀?shù)(3)pH；整個發(fā)酵過程維持在6．6—7．2，菌絲生長良好，發(fā)酵單位穩(wěn)定。如在接種后24h內(nèi)pH過低或偏高，則菌絲生長較慢，生物合成水平的差別也很顯著，特別在發(fā)酵前期，當pH為5．7—6．3時發(fā)酵最終的單位僅為對照的一半。曾用0.2mol磷酸鹽緩沖液進行試驗，將它加到72h的發(fā)酵液內(nèi)，當PH為5．3時已經(jīng)生成的紅霉家全部失效，菌絲自溶。當PH為6．3時紅霉素部分失效，pH在6．7—6．9有利于紅霉家的生物合成。(4)發(fā)酵液濃度的控制：在一定的強度范圍內(nèi)，紅霉素c含量與發(fā)酵液濃度呈負相關(guān)的關(guān)系。因此，適當提高發(fā)酵液濃度能減少紅霉素c組分的比例，從而保證成品質(zhì)量。控制參數(shù)(5)發(fā)酵液熱度與攪拌功效、氮源補入量及培養(yǎng)溫度有關(guān)。通過減慢攪拌轉(zhuǎn)速、改變攪拌葉型式、降低罐溫、增加有機氮源補量，滴加氨水等能提高發(fā)酵液的濃度。但熱度過高會影響溶解氧的濃度，單位明顯下降，所以必須因地制宜進行發(fā)酵工藝控制。(6)泡沫與消沫：因發(fā)酵培養(yǎng)基有黃豆餅粉，故在培養(yǎng)基消毒及通蒸氣時泡沫較多。一般以植物油(豆油或菜油)做消沫劑，不宜一次多量加入。發(fā)酵過程中參數(shù)不控性與模糊控制的應(yīng)用盡管對發(fā)酵過程的環(huán)境參數(shù)，如PH，發(fā)酵溫度，溶解氧濃度D0都可以控制得很好，但是由于微生物生長過程是高度的非線性和時變性，關(guān)鍵變量，如菌絲濃度、總糖濃度不可在線測量，使發(fā)酵過程的控制問題變得很復(fù)雜。采用計算機控制技術(shù)對抗生素發(fā)酵過程進行實時自動控制、管理和優(yōu)化操作，不但能解決上述存在的問題，而且可減輕操作人員的勞動強度，提高自動化水平，穩(wěn)定生產(chǎn)，提高發(fā)酵系數(shù)，降低原耗與能耗?！痘赩B的紅霉素發(fā)酵過程監(jiān)控系統(tǒng)的設(shè)計》利用VB、MATLAB和SQLSe~er設(shè)計了一個紅霉素發(fā)酵過程的上位機監(jiān)控系統(tǒng)，能對紅霉素發(fā)酵過程的溫度、pH、溶氧、轉(zhuǎn)速等參數(shù)進行數(shù)據(jù)采集、處理，并采用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法來預(yù)測菌絲濃度、基質(zhì)濃度和產(chǎn)物濃度，同時根據(jù)參數(shù)值將相應(yīng)的控制量傳送給下位機來實現(xiàn)對參數(shù)的實時控制。該系統(tǒng)具有良好的數(shù)據(jù)處理能力和圖像顯示能力，通過監(jiān)控界面操作，能方便地實現(xiàn)對紅霉素發(fā)酵過程的實時監(jiān)控和自動控制，優(yōu)化生產(chǎn)工藝，提高設(shè)備的可用率。《紅霉素發(fā)酵過程前期參數(shù)相關(guān)分析及調(diào)控》對紅霉素發(fā)酵過程前期調(diào)控策略進行了研究，從宏觀代謝流的變化著手，對表征細胞代謝特征的參數(shù)進行了相關(guān)分析，對發(fā)酵前期的攝氧率(OUR)、二氧化碳釋放率(CER)及呼吸商(RQ)相關(guān)變化及紅霉素發(fā)酵前期CER與pH的變化進行了分析，確定了合適的調(diào)控方式，在工業(yè)規(guī)模發(fā)酵罐上通過控制發(fā)酵過程前期補糖速率等措施，使發(fā)酵平均水平提升了33.3%《紅霉素發(fā)酵生產(chǎn)后期的調(diào)控研究》在發(fā)酵后期向發(fā)酵液中加入適量的ATP、硫酸鎂、檸檬酸和L2蛋氨酸時,對提高發(fā)酵液的生物效價和ErA的相對百分含量有較明顯的積極作用.研究發(fā)現(xiàn),每100ml發(fā)酵液中添加上述物質(zhì)的最優(yōu)組合為:ATP為0.005g、硫酸鎂為0.18g、檸檬酸為0.16g和L2蛋氨酸為0.02g。《紅霉素生產(chǎn)及其有效組分轉(zhuǎn)化的優(yōu)化》以紅霉素生產(chǎn)菌紅色鏈霉菌HB為研究對象,根據(jù)紅霉素生物合成機理,以促進甲基化轉(zhuǎn)化和強化基礎(chǔ)代謝為主要手段,在利用搖瓶和50L罐發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素的過程中,在大約127h的時候,向發(fā)酵液中流加ATP、L-Met、MgSO4和檸檬酸,采用高效液相色譜儀(HPLC)對最終發(fā)酵液進行檢測,紅霉素的有效組分A的相對百分含量由原來的73%提高到88%以上,對最終發(fā)酵液進行生物測定,其生物效價亦得到明顯提高,實現(xiàn)了紅霉素發(fā)酵生產(chǎn)的優(yōu)化?！都t霉素A發(fā)酵條件的優(yōu)化》采用兩水平因子設(shè)計和響應(yīng)面設(shè)計,以紅霉素A的相對含量為目標函數(shù)建立二項式模型,經(jīng)Design-Expert6.0.10軟件分析得到優(yōu)化結(jié)果：每100ml發(fā)酵液中分別補入：

ATP0.00102g、L-蛋氨酸0.01132g、硫酸鎂0.0224g、檸檬酸0.0278g、氯化錳0.0034g、L-蘇氨酸0.0288g和L-絲氨酸0.0384g時,可使紅霉素A相對含量由80.2%提高到89.2%?！队袡C氮源對紅霉素發(fā)酵影響的具體分析》本文的研究結(jié)果表明紅色糖多孢菌在搖瓶中氮源的種類或比例不同,紅霉素的效價也明顯不同。通過對含有不同氮源培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分進行計算,并對其結(jié)果進行逐步回歸,我們得到黃豆餅粉、棉籽餅粉、啤酒酵母粉和玉米漿等氮源具有的營養(yǎng)成分中Thr是影響效價的主要因子。向發(fā)酵水平較低的對照培養(yǎng)基中添加0.05%Thr后紅霉素的效價提高了22.85%?！抖褂驮诩t霉素發(fā)酵中的作用及作用機制的研究》本文通過在紅霉素發(fā)酵罐基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加豆油和發(fā)酵過程中進行補加豆油實驗發(fā)現(xiàn),補加豆油紅霉素效價有明顯的提高。發(fā)酵罐基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補加豆油效價可以提高43.1%,發(fā)酵過程補加豆油可以使效價提高69.7%。《正丙醇銅離子煙酰胺對紅霉素合成的作用》在搖瓶培養(yǎng)過程中,發(fā)酵初期加入正丙醇可使紅霉素的效價提高49.31%,正丙醇提高了丙酸激酶的比活力,表現(xiàn)出對該酶誘導(dǎo)作用,而對丙酰CoA合成酶比活力無影響。加入銅離子和煙酰胺可使紅霉素效價分別提高24%和17%?！躲f對紅霉素生物合成的影響》在利用糖多孢紅色鏈霉菌HB發(fā)酵生產(chǎn)紅霉素的過程中，于48h向發(fā)酵液中加入鉬酸鈉，通過對代謝途徑關(guān)鍵調(diào)控酶活力的測定以及運用高效液相色譜法對發(fā)酵液中相關(guān)有機酸含量的測定，結(jié)論顯示：當發(fā)酵液中鉬酸鈉的加入量為0．056g／10mL時，部分代謝流向有利于紅霉素生物合成的方向遷移，在一定程度上提高了紅霉素的生產(chǎn)速率和產(chǎn)量．《Co2+對紅霉素生物合成的影響》研究了紅霉素生物合成過程中糖代謝相關(guān)的關(guān)鍵酶己糖激酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶、磷酸果糖激酶和異檸檬酸脫氫酶,以及合成紅霉內(nèi)酯環(huán)