真核表達系統(tǒng)

真核表達系統(tǒng)酵母絲狀真菌昆蟲哺乳動物細胞轉(zhuǎn)基因動物植物反應(yīng)器1可編輯課件PPT酵母表達系統(tǒng)的優(yōu)缺點遺傳背景清楚（基因組是大腸桿菌的3.5倍）增殖快（90min/代），培養(yǎng)容易，產(chǎn)量較高易于研究突變與基因功能，如構(gòu)建酵母人工染色體等可以進行轉(zhuǎn)錄和翻譯后修飾加工提純工藝復(fù)雜，成本高，制品純度達不到要求，制品免疫原性差，接種劑量大2可編輯課件PPT酵母載體的基本結(jié)構(gòu)DNA復(fù)制起始區(qū)：2μ質(zhì)粒和自主復(fù)制序列選擇標(biāo)記：營養(yǎng)缺陷型和顯性選擇（抗藥）整合介導(dǎo)區(qū)：同源重組，決定整合位置和拷貝數(shù)有絲分裂穩(wěn)定區(qū)：幫助載體平均分配表達盒轉(zhuǎn)錄啟動子終止子分泌信號序列3可編輯課件PPT酵母表達系統(tǒng)中載體的種類按載體在酵母中的復(fù)制形式分為：YIp：酵母整合型載體YRp：酵母自主復(fù)制型載體YCp：酵母含著絲粒片段載體YEp：酵母附加體型載體YAC：酵母人工染色體4可編輯課件PPT昆蟲表達系統(tǒng)桿狀病毒基因組：閉環(huán)雙鏈DNA，88-166kb啟動子：桿狀病毒科核多角體病毒的多角蛋白強啟動子表達系統(tǒng)桿狀病毒表達系統(tǒng)（BEVS）家蠶核型多角體病毒-家蠶表達系統(tǒng)宿主：鱗翅目、膜翅目、雙翅目、鞘翅目、直翅目、脈翅目、毛翅目的600多種昆蟲克隆基因方法：轉(zhuǎn)移載體→共轉(zhuǎn)染→同源重組→空斑篩選→純化→重組病毒5可編輯課件PPT桿狀病毒表達系統(tǒng)優(yōu)點容量大：能插入12kb的外源基因高表達：polh基因啟動子是目前所知的最強的真核啟動子；產(chǎn)物對宿主影響??；產(chǎn)物可結(jié)晶高效：可同時表達多個基因安全：桿狀病毒對脊椎動物無病原性具加工修飾功能：昆蟲細胞較高等家蠶易飼養(yǎng)6可編輯課件PPT哺乳動物細胞表達表達系統(tǒng)常用宿主細胞哺乳動物細胞常用載體真核細胞表達元件哺乳動物基因轉(zhuǎn)移的遺傳標(biāo)記基因表達的檢測方法7可編輯課件PPT哺乳動物細胞表達的優(yōu)點重組DNA易轉(zhuǎn)染，遺傳穩(wěn)定，可重復(fù)識別和去除內(nèi)含子進行翻譯后修飾磷酸化、糖基化、二硫鍵、寡聚體等的形成、高級結(jié)構(gòu)的正確折疊產(chǎn)品的構(gòu)型正確率高，可被改造成類人體源性，免疫源性好可分泌至培養(yǎng)基，提純工藝簡單，成本低可用于基因治療8可編輯課件PPT常用宿主細胞細胞名稱來源已投放產(chǎn)品BHK-21地鼠幼鼠腎凝血Ⅷ因子CHO-K1中國倉鼠卵巢tPA，Ⅷ因子，EPO，G-CSF等C127小鼠乳腺腫瘤GHMDCK長耳狗腎臟獸用疫苗NamalwaBurkitt淋巴瘤病人的類淋巴母細胞EPO，LT，tPA，IFNVero成年非洲綠猴腎HBsAg，GH鼠骨髓瘤細胞骨髓瘤tPA，抗體COSSV40轉(zhuǎn)化的綠猴腎細胞CD34，CD69，TGF9可編輯課件PPT真核細胞表達元件原核DNA序列啟動子增強子拼接信號終止子和多聚腺苷化信號篩選標(biāo)記動物病毒基因序列10可編輯課件PPT原核DNA序列原核復(fù)制子抗生素抗性基因多克隆位點11可編輯課件PPT啟動子真核啟動子：RNA聚合酶（Ⅱ）結(jié)合并起動轉(zhuǎn)錄的DNA序列一般包括轉(zhuǎn)錄起始點及其上游約100-200bp序列，包含有若干具有獨立功能的DNA序列元件，每個元件約長7-30bp核心啟動子元件：RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄所必需的最小DNA序列，包括轉(zhuǎn)錄起始點及其上游-25/-30bp處的TATA盒。單獨起作用時只能確定轉(zhuǎn)錄起始位點和產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄上游啟動子元件包括通常位于-70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距轉(zhuǎn)錄起始點更遠的上游元件。與相應(yīng)的蛋白因子結(jié)合改變轉(zhuǎn)錄效率。不同基因具有不同的上游啟動子元件組成，其位置也不相同，即不同的基因表達分別有不同的調(diào)控12可編輯課件PPT哺乳類RNA聚合酶Ⅱ啟動子

中常見的元件元件名稱共同序列結(jié)合的蛋白因子名稱

分子量

結(jié)合DNA長度

TATAboxTATAAAATBP30,000~10bpGCboxGGGCGGSP-1105,000~20bpCAATboxGGCCAATCTCTF/NF160,000~22bpOctamerATTTGCATOct-176,000~20bp

Oct-253,000~23bpkBGGGACTTTCCNFkB44,000~10bpATFGTGACGTAFT?20bp13可編輯課件PPT常用啟動子Rous肉瘤啟動子（RSV）巨細胞病毒啟動子（CMV）SV40啟動子14可編輯課件PPT增強子增強子：是一種能夠提高轉(zhuǎn)錄效率的順式調(diào)控元件，最早是在SV40病毒中發(fā)現(xiàn)長約200bp的一段DNA，可使旁側(cè)的基因轉(zhuǎn)錄提高100倍，其后在多種真核生物、甚至在原核生物中都發(fā)現(xiàn)了增強子增強子通常占100-200bp長度，也和啟動子一樣由若干組件構(gòu)成，其基本核心組件常為8-12bp，可以單拷貝或多拷貝串連形式存在15可編輯課件PPT增強子的作用特點提高同一鏈上基因轉(zhuǎn)錄效率，可遠距離起作用，通常距離1-4kb、但遠至30kb仍能發(fā)揮作用，在基因的上游或下游都能起作用與其序列的正反方向無關(guān)要有啟動子才能發(fā)揮作用。但增強子對啟動子沒有嚴(yán)格的專一性，同一增強子可以影響不同類型啟動子的轉(zhuǎn)錄增強子的作用機理雖然還不明確，但與其他順式調(diào)控元件一樣，必須與特定的蛋白質(zhì)因子結(jié)合后才能發(fā)揮增強轉(zhuǎn)錄的作用增強子一般具有組織或細胞特異性，許多增強子只在某些細胞或組織中表現(xiàn)活性，是由這些細胞或組織中具有特異性蛋白質(zhì)因子所決定的16可編輯課件PPT常用增強子LTR：Rous肉瘤病毒基因長末端重復(fù)序列人類巨細胞病毒增強子SV40病毒增強子17可編輯課件PPT終止信號和polyA信號真核基因轉(zhuǎn)錄的終止信號與機制還不明確polyA增加mRNA的的穩(wěn)定性多聚腺苷化所需的兩種序列位于polyA下游GU豐富區(qū)或U豐富區(qū)位于polyA上游11-30bp處的5`-AAUAAASV40polyA信號18可編輯課件PPT遺傳性標(biāo)記胸苷激酶基因（tk）選擇系統(tǒng)二氫葉酸還原酶基因（dhfr）選擇系統(tǒng)新霉素抗性基因（neo）選擇系統(tǒng)氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（cat）選擇系統(tǒng)19可編輯課件PPT胸苷激酶（TK）基因選擇系統(tǒng)TK是核苷酸補救合成途徑的一個關(guān)鍵酶內(nèi)源性缺陷tk的宿主細胞——小鼠LMTK—細胞HAT選擇法H：次黃嘌呤；補救合成三種核苷酸的原料A：氨基喋呤；抑制四氫葉酸合成T：胸苷；補救合成dTTP的原料tk—細胞的鑒別與獲得：5`-溴脫氧核糖尿苷（BUdR）篩選20可編輯課件PPT二氫葉酸還原酶（DHFR）基因選擇系統(tǒng)DHFR：真核細胞生物合成核苷酸的關(guān)鍵酶，功能是催化二氫葉酸還原成四氫葉酸篩選劑：葉酸類似物——氨基喋呤或氨甲喋呤dhfr—缺陷型細胞——CHO細胞正常細胞可通過提高氨甲喋呤濃度篩選突變型dhfr基因的導(dǎo)入擴大篩選宿主細胞的范圍21可編輯課件PPT新霉素抗性基因選擇系統(tǒng)新霉素（neo）：即G418，一種氨基糖苷類抗生素，影響80S核糖體功能核蛋白質(zhì)的合成新霉素抗性基因編碼3`-磷酸轉(zhuǎn)移酶降解G418適用于所有的真核細胞22可編輯課件PPT氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT）基因選擇系統(tǒng)CAT：大腸桿菌Tn9轉(zhuǎn)座子編碼的催化氯霉素乙?；磻?yīng)的蛋白質(zhì)真核細胞缺乏CAT導(dǎo)入CAT可作為報告基因常用于瞬時表達研究23可編輯課件PPT表位標(biāo)記表位：抗原決定簇即抗原分子于一特定抗體結(jié)合的化學(xué)基團，一般由少至幾個氨基酸的多肽組成用于重組DNA技術(shù)的示蹤、分析、純化（親和）優(yōu)點用一種抗體可鑒別不同重組蛋白不影響蛋白功能有利于研究蛋白功能常用表位：6His；FLAG；LZ等24可編輯課件PPT構(gòu)建含表位的重組體使用常用密碼子注意克隆位點（限制性酶切位點）相符5`端加上起始密碼子ATG3`端加上終止密碼子可插入蛋白酶切位點基因，以利于產(chǎn)生天然蛋白其他常規(guī)構(gòu)建載體的注意點25可編輯課件PPT真核表達載體質(zhì)粒：真核表達元件、真核抗性病毒載體：改建后SV40病毒腺病毒反轉(zhuǎn)錄病毒痘苗病毒26可編輯課件PPT病毒基因組的結(jié)構(gòu)特點病毒基因組大小相差較大,與細菌或真核細胞相比，病毒的基因組很小病毒基因組可以由DNA組成，也可以由RNA組成多數(shù)RNA病毒的基因組是由連續(xù)的核糖核酸鏈組成基因重疊即同一段DNA片段能夠編碼兩種甚至三種蛋白質(zhì)分子病毒基因組的大部分是用來編碼蛋白質(zhì)的病毒基因組DNA序列中功能上相關(guān)的蛋白質(zhì)的基因或rRNA的基因往往叢集在基因組的一個或幾個特定的部位,形成一個功能單位或轉(zhuǎn)錄單元除了反轉(zhuǎn)錄病毒以外，一切病毒基因組都是單倍體，每個基因在病毒顆粒中只出現(xiàn)一次噬菌體（細胞病毒）的基因是連續(xù)的；而真核細胞病毒的基因是不連續(xù)的27可編輯課件PPT病毒載體優(yōu)點真核細胞可識別的啟動子報告基因可持續(xù)復(fù)制（感染周期）部分載體可整合入基因組部分載體本身帶有完整的復(fù)制及表達元件部分載體具有宿主細胞特異性識別受體假病毒顆粒28可編輯課件PPT猿猴空泡病毒（SV40）種屬分類：乳多空病毒科多瘤病毒屬雙鏈共價閉合環(huán)狀DNA（cccDNA），5243bp20面體立體對稱結(jié)構(gòu)，直徑45nm以EcoRl內(nèi)切酶切點作為0點分成100等分，Ori點是DNA雙向復(fù)制的起紿點早期編碼進程是逆時鐘方向，在病毒DNA自制前，編碼的蛋白質(zhì)(大T、小T抗原)與誘發(fā)宿主細胞的轉(zhuǎn)化有關(guān)晚期編碼區(qū)進程為順時鐘方向，是在病毒DNA復(fù)制開始以后，編碼的蛋白質(zhì)為三種病毒殼體蛋白VP1、VP2和VP3，這些蛋白是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，不參與細胞的轉(zhuǎn)化過程29可編輯課件PPT30可編輯課件PPTSV40感染細胞模式感染形式：隨宿主的不同產(chǎn)生的效應(yīng)不同許可性細胞——裂解性感染（猿猴細胞）非許可性細胞——整合入染色體（嚙齒動物細胞）半許可性細胞——既不整合也不裂解（人細胞）31可編輯課件PPTSV40載體類型取代型重組病毒去掉晚期區(qū)一段DNA，外源基因可插入需輔助病毒感染可形成病毒顆粒重組病毒-質(zhì)粒載體保留病毒復(fù)制相關(guān)序列插入細菌質(zhì)粒序列，可在大腸桿菌種復(fù)制增殖不形成病毒顆粒32可編輯課件PPTSV40及衍生載體的優(yōu)點可在多種細胞中表達基因組DNA、cDNA均可表達SV40的復(fù)制起始點廣泛宿主范圍的啟動子多聚A信號DNA拼接供體和信號（剪接內(nèi)含子）部分載體含有報告基因33可編輯課件PPT感染宿主范圍有限復(fù)制只能在猿猴細胞中載體DNA分子量小，容量小在用輔助病毒混合感染時，有野生化危險SV40及衍生載體的缺點34可編輯課件PPT35可編輯課件PPT痘苗病毒雙鏈DNA病毒180kb，編碼200種左右的蛋白可獨立的在細胞質(zhì)中復(fù)制轉(zhuǎn)錄36可編輯課件PPT痘苗病毒載體優(yōu)越性宿主范圍廣泛容量大——插入的外源基因可達25kb瞬時表達無致癌性——本身即需接種可作為重組活疫苗的載體37可編輯課件PPT痘苗病毒載體的缺點分子量大，操作較困難無剪接功能——不能插入含內(nèi)含子的基因外源基因必須插入非必需區(qū)38可編輯課件PPT構(gòu)建重組痘苗病毒流程tk基因插入質(zhì)粒tk基因內(nèi)插入痘病毒早期啟動子接上多克隆位點接上外源基因野毒株感染細胞導(dǎo)入重組載體同源重組——含外源基因的tk基因取代篩選含外源基因的重組病毒感染敏感宿主細胞表達外源基因39可編輯課件PPT腺病毒Ad病毒顆粒的直徑為70-90nm，呈20面體立體對稱型，核心外層的殼體由252個殼粒亞單位組成雙股線型DNA，DNA約占病毒重量的11-14%不同亞型Ad病毒的DNA的G+C%含量不同，與其致瘤性能強弱有關(guān)Ad2基因組的早期轉(zhuǎn)錄區(qū)有6個獨立的區(qū)域:IA(EIA)、EIB、E2(E2A和E2B)、E3、E4Ad2基因組約長36kb，EIA和EIB與Ad2的啟動和轉(zhuǎn)化細胞密切有關(guān)腺病毒雖然分布廣泛，其中某些亞型對動物具強致瘤性，但是從A組到E組，迄今尚未證明與人類腫瘤有病因?qū)W上的聯(lián)系40可編輯課件PPT腺病毒載體容量較大：可插入7kb易培養(yǎng)、純化復(fù)制與轉(zhuǎn)錄依賴與宿主聚合酶不整合釋放殼體蛋白，引起免疫反應(yīng)41可編輯課件PPT基因的導(dǎo)入方法光穿孔法：激光；懸浮細胞沖擊波：活體局部的基因轉(zhuǎn)移基因槍法：即微粒轟擊；動物細胞，更適用于植物細胞穿孔法：脈沖電場；Cytomix緩沖液；70%細胞死亡時效率最高磷酸鈣共沉淀法脂質(zhì)體法：Lipofectin；陽離子抗體轉(zhuǎn)染法：抗CD3，CD34或表面免疫求蛋白其他：超聲波法；微注射法原生質(zhì)體融合法；反轉(zhuǎn)錄病毒感染法42可編輯課件PPT表達產(chǎn)物的檢測技術(shù)Western印跡法——免疫學(xué)方法——抗原-抗體反應(yīng)熒光顯微鏡法——表位標(biāo)記的抗體與直接抗體進行熒光標(biāo)記——免疫學(xué)方法43可編輯課件PPTWestern印跡法蛋白樣品制備→

SDS（按分子量大?。娹D(zhuǎn)移→一抗（特異性）→二抗→顯色敏感度：1-5ng44可編輯課件PPT樣品的制備裂解細胞電泳加樣緩沖液裂解細胞（煮沸5-10min）抽提細胞蛋白（超聲）45可編輯課件PPTSDS丙烯酰胺和N，N`-亞甲雙丙烯酰胺交聯(lián)，形成一定孔徑的分離介質(zhì)，孔徑大小由濃度決定，具有分子篩效應(yīng)在不連續(xù)的緩沖系統(tǒng)，具有濃縮效應(yīng)蛋白質(zhì)本身的電荷效應(yīng)SDS：陰離子去污劑，與蛋白質(zhì)結(jié)合SDS濃度大于0.05%時，使樣品中的蛋白質(zhì)帶同樣密度的電荷電泳時使蛋白遷移只與分子量有關(guān)，且呈線性（對數(shù)分子量與遷移率），可測定分子量46可編輯課件