端粒端粒酶在盆腔脫垂器官韌帶組織中的表達研究-國際臨床研究雜志

【摘要】目的研究端粒/端粒酶在盆底結(jié)締組織中的表達，探討端粒/端粒酶在基因水平參與盆腔器官脫垂（POP）的發(fā)生機制。方法隨機選取35-75歲的患者入組40例，實驗組為因子宮脫垂行子宮切除術(shù)的患者；對照組為因良性疾病行全子宮除的患者。對手術(shù)標本的子宮骶韌帶、圓韌帶組織通過Masson染色、IHC等實驗方法檢測其中組織細胞的端粒酶、I型膠原（COLLI）、Ⅲ型膠原（COLLIII）等指標的表達情況。結(jié)果實驗組與對照組COLLI、COLLⅢ的表達有統(tǒng)計學差異，但兩組間TERT表達無統(tǒng)計學差異。結(jié)論盆腔器官脫垂患者的子宮韌帶中組織COLLⅠ、COLLⅢ表達顯著下降，但端粒/端粒酶在盆腔臟器脫垂形成中的影響需進一步的實驗驗【收稿日期】2023年11月10日【出刊日期】2023年12月29日【DOI】10.12208/j.ijcr.20230373Expressionoftelomere/telomeraseinligamenttissueofpelvicprolapseorgansDongyongLiu,YiBai,LingLongThePeople'sHospitalofTongliangDistrict,Chongqing【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheexpressionoftelomere/telomeraseinpelvicconnectivetissueandexplorethemechanismoftelomere/telomeraseinvolvementintheoccurrenceofpelvicorganprolapse(POP)atthegenelevel.Methods40patientsaged35to75wererandomlyselected.Theexperimentalgroupconsistedofpatientswhounderwenthysterectomyduetouterineprolapse;Thecontrolgroupconsistedofpatientswhounderwenttotalhysterectomyduetobenignuterinediseases.Theexpressionoftelomerase,COLI,COLIIIandotherindicatorsinthetissuecellsoftheuterinesacralligamentandroundligamenttissuesofsurgicalspecimenswasdetectedusingexperimentalmethodssuchasMassonstainingandIHC.ResultsTherewasastatisticaldifferenceintheexpressionofCOLLIandCOLLIIIbetweenthetwogroups,buttherewasnosignificantdifferenceinTERTexpression.ConclusionTheexpressionofCOLLIandCOLLIIIintheuterineligamentsofpatientswithpelvicorganprolapsehasdecreasedsignificantly,buttheeffectoftelomeresintheformationofpelvicorganprolapseneedstobefurtherexperimentallyverified.【Keywords】Pelvicorganprolapse;COLLI;COLLIII;Telomere;TERT盆腔器官脫垂是指盆腔器官（膀胱、腸或子宮）疝的生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴重影響[1]。盆腔器官脫垂的發(fā)生是多手術(shù)和遺傳因素等。盆底疾病影響近1/3的絕經(jīng)前婦女和近1/2的絕經(jīng)后婦女。除了伴隨疾病的軀體癥狀，它還會對患者產(chǎn)生情緒影響，包括孤立、焦慮和抑郁，導致社會心理壓力。因此需要對POP的病因及治療作進一步研究[2]。研究證實，端粒/端粒酶的活性增加、端粒延長，導致細胞永生化并促進腫瘤的發(fā)生，部分慢性疾病、退化性疾病如高血壓、心血管疾病、腰椎間盤突出癥等疾病的發(fā)生發(fā)展也有端粒功能的改變。POP作為一個與衰老相關(guān)的疾病，端粒/端粒酶的功能改變也有可能參與了盆腔器官脫垂的形成及發(fā)展。本研究擬通過Mosson染色、免疫組化蛋白印跡技術(shù)對盆腔器官脫垂患者子宮韌帶組織中的COLLI、COLLⅢ表達及端粒酶活性進行檢測，旨在進一步驗證端粒/端粒酶在POP發(fā)生、發(fā)展中的作用。1材料與方法1.1臨床資料選取40-80歲的婦科患者入組37例，分為兩個大組，實驗組為因子宮脫垂行子宮手術(shù)的患者；對照組為其他疾病行子宮除的患者。對照組：年齡為46～6均年齡為51.25歲。1.2病理資料近子宮端的骶韌帶或圓韌帶，長度1cm。1.3實驗方法收集兩組患者近子宮端骶韌帶或圓韌帶組織約1cm長，通過Masson染色證實為韌帶組織，IHC實驗方法檢測其中組織中端粒酶、COLI、COLIII等指標的表達情況。1.3.1實驗試劑Masson三色染色試劑盒proteintechproteintech1.3.2Masson定性觀察盆底韌帶結(jié)締組織中膠原纖維的分布情況，實驗步驟將烘好的片子放入不同試劑中進行脫蠟水化，具體為：脫蠟：把載玻片置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各20分鐘；酒精中各5分鐘，流水沖洗3分鐘；脫蠟水化后，在Weigert鐵蘇木素A、B液等比例混合液中染色8分鐘，流水沖洗1分鐘；1%酒精鹽酸分化10秒，流水沖洗3滴加磷鉬酸溶液處理4分鐘，傾去載玻片上磷鉬酸溶片上染液，直接用1%冰醋酸水溶液沖洗玻片至無藍色脫出；然后進行梯度脫水：將載玻片依次放入75%、二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各1分鐘，后用中性樹膠與蓋玻片進行封片即完成制片。1.3.3ICH免疫組化半定量檢測盆底韌帶組織中COLI、COLII及TERT的表達，實驗步驟按照1.2.2中方法將烘好的片子脫蠟水化后對組織進行抗原修復。將切片放進配制好的EDTA抗原修復液中，在微波爐里低火保溫20min。然后自然冷卻，1×PBS洗5min×3次。用免疫組化筆將組織圈起來，用5%牛奶封閉液在干燥箱放置30min，1×PBS洗5min×3次。使用過氧化物酶封閉液在室溫下阻斷10min，1×PBS洗5min×3次。一抗375min×3次；二抗37℃孵育30min，1×PBS洗5min×3次。將配制好的DAB染液滴加至載玻片組織上，染色3-5min后，放入PBS中終止染色。載玻片放入蘇木素染缸中染色1min后放入流水中終止染色，緩水沖洗100%、100%梯度乙醇各1min脫水，然后置于二甲苯中透明1min，回到100%乙醇涮一下，除掉二甲苯，用吹風機完全吹干載玻片，滴加1滴中性樹脂蓋玻片并封片。1.4統(tǒng)計學方法實驗圖片染色程度應用圖像處理軟件ImageJ進行分析；實驗數(shù)據(jù)采用GraphPadSoftware公司的款數(shù)據(jù)處理與圖形軟件GraphPadPrism（9.2.0，2021版）進行T檢驗分析，P值＜0.05顯示差異有統(tǒng)計學意義。2結(jié)果2.1Masson染色檢測韌帶組織中膠原纖維的含量表達Masson染色結(jié)果顯示，對照組和實驗組均有大量膠原纖維，無明顯差異，如圖1，2。2.2ICH檢測韌帶組織中COLI、COLIII、TERT蛋白的表達免疫組化檢測顯示，實驗組與對照組相比，CollⅠ和CollⅢ表達量明顯下低，統(tǒng)計顯示有顯著差異（p<0.05TERT蛋白的表達量在實驗組與對照組之間無統(tǒng)計學差異（p＞0.05），但實驗組TERT表達平均值略低，如圖3-圖8。3討論端粒及端粒酶在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用已經(jīng)被眾多實驗研究所證實，而端粒在衰老性疾病及慢性疾病中的作用也已經(jīng)被很多研究發(fā)現(xiàn)所證實，如高血壓、心血管疾病、圓錐角膜、腰間盤退行病變等。端粒/端粒酶的相關(guān)研究一直是多年來科學研究的前沿熱點，其發(fā)展變化關(guān)系到腫瘤、生殖、退行性病變等一系列生理及病理變化[3]。POP是一種多因素疾病，嚴重影響女性的生活質(zhì)量。目前的研究認為POP的發(fā)生與盆底組織結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維對器官有支撐作用，而這種支撐需要細胞外基質(zhì)各成分含量和比例的平衡，無論何種原因引起的失衡均會降低組織的機械強度，使POP易于發(fā)生。比如有研究證實，盆底功能障礙患者盆底支持組織中膠原蛋白含量減少并不是因為合成減少，而是由于膠原蛋白降解增多，這與轉(zhuǎn)換生長因子-β（TGF-β)對MMPs和TIMPs的調(diào)節(jié)作用有關(guān)[4]。本研究結(jié)果也顯示，子宮脫垂患者標本組織中的COLⅠ和COLⅢ的表達顯著減少，證實膠原纖維含量的變化與POP的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。端粒/端粒酶復合體的活性代表著細胞增值活力，直接影響細胞增值分化。在腫瘤細胞組織內(nèi)，端粒酶活性會較正常細胞活性高，TERT蛋白含量升高，細胞無限分裂最終形成腫瘤。而在某些慢性病癥和衰老性病癥中，端粒酶活性降低會伴隨端粒長度減小，影響組織衰老，如慢性肝臟病癥、高血壓疾病、椎間盤推行病變等。研究表明，增加外源性TERT基因能夠增加端粒酶活性，延長端粒長度，阻止/恢復椎間盤細胞退變的POP以盆底纖維和肌肉退行病變及功能障礙為主要表現(xiàn)，已證實盆腔結(jié)締組織細胞有異常凋亡的現(xiàn)象，相關(guān)膠原合成減少，韌帶組織中P16、PGE2/COX2標志物升高，這也證實POP有較強衰老特征[5]。這些標志物已經(jīng)被證實與端粒酶有著多種通路的聯(lián)系，因此有理由推測端粒/端粒酶也可能參與盆腔器官脫垂的發(fā)生及發(fā)展。本研究中兩組間ICH檢測TERT表達，數(shù)據(jù)平均值提示POP組TERT蛋白表達降低，但統(tǒng)計學結(jié)果未見明顯差異。分析兩組間數(shù)據(jù)及實驗過程，可能與實驗標本數(shù)量較少、年齡分布不均、以及實驗標本取材于圓韌帶和骶韌帶兩種組織造成偏移有關(guān)。POP作為一種臨床上和衰老明顯相關(guān)的疾病，我們有理由推測其發(fā)生發(fā)展與端粒/端粒酶的變化可能相關(guān)，本研究也首次提出端粒/端粒酶可能參與POP發(fā)生、發(fā)展，有可能通過調(diào)控成纖維細胞細胞外基質(zhì)的分泌，如膠原蛋白的產(chǎn)量及比例在POP發(fā)生中起作用。為驗證這一結(jié)論，后續(xù)研究需要加大樣本量，剔除本類型等偏移因素，或進行分層分析，明確端粒/端粒