分析化學第11章-熒光分析法

第11章熒光分析法概述基本原理定量分析方法熒光分析技術及應用

11.1概述1.光致發(fā)光：物質(zhì)受到光照射時，除吸收某種波長的光之外還會發(fā)射出比原來所吸收光的波長更長的光，這種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光。2.熒光(fluorescence)：物質(zhì)分子接受光子能量被激發(fā)后，從激發(fā)態(tài)的最低振動能級返回基態(tài)時發(fā)射出的光。3.熒光分析法(fluorometry)：根據(jù)物質(zhì)的熒光譜線位置及其強度進行物質(zhì)鑒定和含量測定的方法。熒光分析法的優(yōu)點：靈敏度高;選擇性好;檢測限達10-10g/mL,最低可達10-12g/mL。11.2熒光分析法的基本原理一、分子熒光(一)分子熒光的產(chǎn)生1.分子的電子能級與激發(fā)過程1)分子的電子能級△E=△Ee+△Ev+△Er2)電子能態(tài)的多重性：M=2S+1S:總自旋量子數(shù)。S＝s1+s2對于

S=1/2+(-1/2)=0M=2S+1=1對應基線單重態(tài)；對于激發(fā)態(tài)

s1=1/2,s2=1/2,S=1/2+1/2=1,M=2×1+1=3三重態(tài)單重態(tài)與三重態(tài)的區(qū)別1）電子自旋方向不同；2）激發(fā)三重態(tài)的能量稍低一些。2.熒光的產(chǎn)生1）激發(fā)過程：基態(tài)分子

激發(fā)單重態(tài)(s1*,s2*)

激發(fā)三重態(tài)

hv2）激發(fā)態(tài)能量傳遞途徑傳遞途徑輻射躍遷熒光磷光內(nèi)轉(zhuǎn)換外轉(zhuǎn)換系間跨越振動弛豫無輻射躍遷1.無輻射躍遷a.振動馳豫(vibrational

relexation):

處于激發(fā)態(tài)各振動能級的分子通過與溶劑分子的碰撞而將部分振動能量傳遞給溶劑分子，其電子則返回到同一電子激發(fā)態(tài)的最低振動能級的過程。如：S1*:V4,V3,V2,V1V0V4V3V2V1V0V4V3V2V1V0V4V3V2V1V0S2*S1*T1*S0λ1λ2λ3λ4acabdefgE圖熒光和磷光產(chǎn)生示意圖吸收b.振動馳豫c.內(nèi)轉(zhuǎn)換d.熒光e.外轉(zhuǎn)換

f.體系間跨越g.磷光12345b.內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換(internalconversion):簡稱內(nèi)轉(zhuǎn)換，當兩個電子激發(fā)態(tài)之間的能量相差較小以致其振動能級有重疊時，受激分子常由高電子能級以無輻射方式轉(zhuǎn)移至低電子能級的過程。如S2*S1*c.外部能量轉(zhuǎn)換(externalconversion)簡稱外轉(zhuǎn)換，溶液中的激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子或與其他溶質(zhì)分子之間相互碰撞而失去能量，并以熱能的形式釋放能量的過程。外轉(zhuǎn)換常發(fā)生在第一激發(fā)單重態(tài)或激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級向基態(tài)轉(zhuǎn)換的過程中。d.體系間跨越(intersystemcrossing):

處于激發(fā)態(tài)的電子發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)而使分子的多重性發(fā)生變化的過程。如：S1*T1*2.輻射躍遷a.熒光發(fā)射：處于任一激發(fā)單重態(tài)的分子，通過內(nèi)轉(zhuǎn)換及振動馳豫，可回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級，然后再以輻射形式發(fā)射光量子而返回至基態(tài)的任一振動能級，這時發(fā)射的光量子稱為熒光。特點：△E激發(fā)光>△E熒光

λ激發(fā)光<λ熒光b.磷光發(fā)射：經(jīng)過體系間跨越的分子再通過振動馳豫降至激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級，分子在激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級可以存活一段時間，然后返回至基態(tài)的各個振動能級而發(fā)出光輻射，稱為磷光。特點：△E激發(fā)三線態(tài)<△E激發(fā)單線態(tài)λ磷光>λ熒光(二)熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜熒光物質(zhì)的兩個特征光譜1.激發(fā)光譜(excitationspectrum):

表示不同激發(fā)波長的輻射引起的物質(zhì)發(fā)射某一波長熒光的相對效率。固定熒光波長(λem)

，改變激發(fā)光波長(λex)，測定F熒光強度，以激發(fā)光波長(λex)為橫坐標，熒光強度為縱坐標作圖，得激發(fā)光譜。2.熒光光譜：

固定激發(fā)光波長(λex)，改變熒光波長(λem)，測定F,以λem

為橫坐標，F(xiàn)為縱坐標作圖，得熒光光譜.300400500nmFab圖硫酸奎寧的激發(fā)光譜(a)

和熒光光譜(b)兩個光譜的作用：1）可用來鑒別熒光物質(zhì)；2）進行熒光測定時選擇適當測定波長的依據(jù)。3.熒光光譜特征1）斯托克斯位移(Stokesshift)

λ熒光>λ激發(fā)光2）熒光光譜的形狀與激發(fā)光波長無關。3）熒光光譜與激發(fā)光譜成鏡像關系。200250300350400450500熒光激發(fā)光譜熒光發(fā)射光譜nm蒽的激發(fā)光譜和熒光光譜二、分子結(jié)構與熒光的關系(一)熒光壽命和熒光效率1.熒光壽命(fluorescelifttime)當除去激發(fā)光源后，分子的熒光強度降低到最大熒光強度的1/e所需的時間，常用τf表示。熒光物質(zhì)從激發(fā)態(tài)到基態(tài)的變化用指數(shù)衰減定律表示：若t=τf,Ft=F0e-1,則K=1/τf以ln(F0/Ft)對t作圖，直線斜率即為1/τf激發(fā)后時間t時的熒光強度衰減常數(shù)激發(fā)態(tài)t=0的熒光強度τf與吸光過程的吸光系數(shù)存在以下關系：

τf

≈10-5/εmax(s)熒光壽命常為10-8~10-10s。利用熒光分子壽命的差別，可以進行熒光物質(zhì)混合物的分析。2.熒光效率(fluorescenceefficiency)又稱熒光量子產(chǎn)率(fluorescencequantumyield),指激發(fā)態(tài)分子發(fā)射熒光的光子數(shù)與基態(tài)分子吸收激發(fā)光的光子數(shù)之比，常用

i

表示。0<

i<1(二)有機化合物分子結(jié)構與熒光的關系發(fā)射熒光的物質(zhì)必須具備兩個基本條件：1）有強的紫外－可見吸收；2）具有一定的熒光效率。1.長共軛結(jié)構芳香環(huán)或雜環(huán)化合物，一般能產(chǎn)生熒光，具有長共軛的ππ*

躍遷。

苯萘蒽λex205nm286nm356nmλem278nm321nm404nm

f0.110.290.36π電子共軛程度越大，

f

越大

，熒光波長長移。2.剛性平面結(jié)構a.剛性結(jié)構與非剛性結(jié)構如聯(lián)苯和芴

聯(lián)苯

f＝0.2

芴

f＝1.0

分子的剛性和共面性越強，熒光效率越大。b.與金屬離子形成絡合物如：8－羥基喹啉和8－羥基喹啉鎂NOHNOMg8-羥基喹啉8－羥基喹啉鎂弱熒光強熒光剛性和共面性增加，可以發(fā)射熒光或增強熒光。c.位阻效應N(CH3)2NaO3SN(CH3)2NaO3S1-二甲氨基萘-7-磺酸鈉

f＝0.751-二甲氨基萘-8-磺酸鈉

f

＝0.03位阻效應使分子共面性下降，熒光減弱。d.順反異構體C=CHHC=CHH反式1,2-二苯乙烯強熒光順式1,2-二苯乙烯無熒光反式有熒光，順式無熒光。3.取代基的影響a.給電子取代基OH苯苯酚F=10F=18λem:270~312nmλem:285~365nm給電子取代基使分子的共軛程度增加，熒光效率提高，熒光波長長移。常見給電子基團：－NH2,－OH,－OCH3,－NHR,－NR2，－CN。b.吸電子取代基苯硝基苯F=10F=0λem:270~312nmλem:——NO2吸電子取代基使π電子共軛程度降低，使熒光減弱甚至熄滅。常見吸電子取代基：－COOH,－NO2,－C=O,－NO,－SH,－NHCOCH3,－F,－Cl,－Br,－I.c.－R,－SO3H,－NH3+等取代基對π電子共軛體系作用小，對熒光作用不明顯。三、影響熒光強度的外部因素1.溫度T,

f,F2.溶劑溶劑極性增強，λem

長移，F(xiàn)

溶劑粘度，F(xiàn)3.酸度如：苯胺NH3+NH2NH-OH-H+OH-H+pH<2無熒光pH=7~12藍色熒光pH>13無熒光4.熒光熄滅劑1）熒光熄滅(熒光焠滅)：熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其他溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強度降低的現(xiàn)象。2）熒光熄滅劑(quenchingmedium):引起熒光熄滅的物質(zhì)。如：鹵素離子，重金屬離子，氧分子，硝基化合物，重氮化合物，羰基，羧基化合物。3）熒光熄滅法(fluorescencequenchingmethod):在熒光物質(zhì)中加入某種熄滅劑后，熒光強度的減弱與熒光熄滅劑的濃度呈線性關系，利用這一性質(zhì)測定熒光熄滅劑的含量，稱為熒光熄滅法。5.散射光(scatteringlight)：定義：當一束平行單色光照射在液體樣品時，大部分光線透光溶液，小部分由于光子和物質(zhì)分子相碰撞，使光子的運動方向發(fā)生改變而向不同角度散射，稱散射光。包括瑞利光和拉曼光。a.瑞利光(Reyleighscatteringlight):光子和物質(zhì)分子發(fā)生彈性碰撞，不發(fā)生能量交換，僅僅是光子運動方向發(fā)生改變，波長與入射光波長相同。b.拉曼光(Ramanscatteringlight):光子和物質(zhì)分子發(fā)生非彈性碰撞，光子運動方向發(fā)生改變，也發(fā)生能量交換，光子把部分能量轉(zhuǎn)移給物質(zhì)分子或從物質(zhì)分子獲得部分能量，發(fā)射出比入射光稍長或稍短的光，稱拉曼光。拉曼光對熒光測定干擾較大。消除拉曼光的方法：選擇適當?shù)募ぐl(fā)波長。瑞利光拉曼光瑞利光拉曼光結(jié)論：無論選擇320nm或350nm為激發(fā)光，熒光峰總是在448nm.而空白溶劑分別在320nm及350nm激發(fā)光照射下測定，測得的實際上是散射光而非熒光。表在不同波長激發(fā)光下主要溶劑的拉曼光波長λex248313365405436水271350416469511

乙醇267344409459500

環(huán)己烷267344408458499四氯化碳—320375418450選擇激發(fā)光波長時，應使溶劑不干擾測定。11.3定量分析方法一、熒光強度與物質(zhì)濃度的關系熒光強度F正比于吸收的光量子Ia和熒光量子效率

：

F=

Ia

Ia=I0-IF∝(I0-I)由朗伯-比耳定律：I=I0×10-εcl

Ia=I0(1-10-

lc

)

F=

I0(1-10-

lc

)=

I0(1-e-2.3

lc

)

當

lc<0.05時，

F=2.3K′I0ECl=KC——熒光定量的依據(jù)。二、定量分析方法1.校正曲線法以熒光強度為縱坐標，對照品溶液的濃度為橫坐標繪制校正曲線，在同樣條件下測定試樣溶液的熒光強度，由校正曲線求出試樣中熒光物質(zhì)的含量。

0.20.40.60.81.01.2C(μg/ml)10080604020·····F-F0------------------------------

Cx熒光法測定硫酸奎寧標準曲線2.比例法當校正曲線通過原點，可取已知量的對照品配制一對照品溶液(Cs),使其濃度在線性范圍內(nèi)，測定熒光強度(Fs),