湖北省結(jié)核病防治研究所實(shí)驗(yàn)室診斷

結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷湖北省結(jié)核病防治研討所周麗平2021年8月魯進(jìn)上傳，以供學(xué)習(xí)結(jié)核分枝桿菌是結(jié)核病的致病因子與確診根據(jù)，結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷就是用直接或間接的方法來(lái)證明患者體內(nèi)存在結(jié)核分枝桿菌。在臨床患者樣本中尋覓結(jié)核分枝桿菌也就是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的主要內(nèi)容。理想的診斷技術(shù)應(yīng)該具有快速、特異、敏感、準(zhǔn)確簡(jiǎn)便和價(jià)錢低廉的特點(diǎn)，這也是結(jié)核界近百年來(lái)技術(shù)研討的方向。目前結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢查主要有：結(jié)核病的細(xì)菌學(xué)診斷〔涂片染色顯微鏡檢查、分枝桿菌分別培育、分枝桿菌藥物敏感性實(shí)驗(yàn)、分枝桿菌菌種鑒定〕結(jié)核病的免疫學(xué)診斷〔皮膚結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)、結(jié)核抗體測(cè)定、結(jié)核抗原測(cè)定、細(xì)胞因子檢測(cè)〕結(jié)核病分子生物學(xué)檢測(cè)〔DNA探針技術(shù)、PCR測(cè)序、PCR定性檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌、雙重實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)和TaqMan探針技術(shù)及等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)〕，目前分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)開(kāi)展非?？?。結(jié)核病病理學(xué)診斷。根據(jù)國(guó)家和我省的“十二五〞結(jié)核病防治規(guī)劃，要求100％的地〔市〕級(jí)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室具備藥物敏感性實(shí)驗(yàn)才干、100％的區(qū)〔縣〕級(jí)實(shí)驗(yàn)室具備分枝桿菌培育才干，同時(shí)根據(jù)我省“三位一體〞任務(wù)開(kāi)展的實(shí)踐情況，目前我省各級(jí)開(kāi)展結(jié)核病診斷的實(shí)驗(yàn)室在涂片、培育、藥敏實(shí)驗(yàn)方面才干還顯缺乏。因此主要從細(xì)菌學(xué)診斷給大家做些引見(jiàn)，同時(shí)簡(jiǎn)介目前我國(guó)正在評(píng)價(jià)和推行運(yùn)用的新診斷技術(shù)?？顾峋科?/p>

涂片制備 每一張玻片都要編號(hào) 涂抹痰標(biāo)本 自然枯燥 加熱固定運(yùn)用鉛筆在磨砂面上編號(hào)運(yùn)用竹木簽進(jìn)展涂抹不得運(yùn)用火焰加熱的方法加速痰膜枯燥×加熱固定涂片太厚適宜太薄痰膜的厚薄好 零落好 不均勻適宜太厚太薄涂片厚度挑取了痰標(biāo)本的膿性部分做螺旋狀軌跡涂抹均勻大小約為2cmX1cm不要太厚透過(guò)染色前的痰膜可以隱約看到報(bào)紙上的字好的涂片Ziehl-Neelsen染色過(guò)程初染(堿性復(fù)紅)脫色(鹽酸酒精)復(fù)染(亞甲蘭)

抗酸菌非抗酸菌堿性復(fù)紅脫色Z－N染色原理－4復(fù)染染色過(guò)程將涂片排放在染色架上滴加堿性復(fù)紅染色液，加熱出現(xiàn)蒸汽后，堅(jiān)持5分鐘流水輕緩沖洗滴加脫色液，堅(jiān)持1分鐘流水輕緩沖洗滴加亞甲蘭復(fù)染液，堅(jiān)持1分鐘流水輕緩沖洗將涂片排放在染色架上，留意間隔滴加堿性復(fù)紅加熱流水沖洗脫色-流水輕緩沖洗復(fù)染流水洗去復(fù)染液在玻片架上自然枯燥涂片抗酸染色檢查方法Z－N染色步驟

操作流程涂痰膜自然干燥復(fù)紅加熱初染5分鐘自然干燥鏡檢流水沖洗美蘭復(fù)染30秒5%鹽酸酒精脫色1-3分鐘流水沖洗流水沖洗熒光染色0.1%金胺“O〞染液染色10分鐘，水洗；3%的鹽酸酒精脫色1-2分鐘，直至無(wú)黃色可見(jiàn)，水洗；0.5%高錳酸鉀溶液復(fù)染1-2分鐘，水洗，晾干。檢測(cè)用10倍目鏡，40倍物鏡，不加油。顯微鏡讀片檢查及結(jié)果報(bào)告單一的抗酸菌“V〞-字形成簇的抗酸菌復(fù)染太濃呵斥的影響適宜的復(fù)染萋尼氏法鏡檢結(jié)果報(bào)告規(guī)范陰性 未發(fā)現(xiàn)抗酸菌/300視野報(bào)告實(shí)踐菌落數(shù) 1-8條/300視野(1+) 3-9條/100視野(2+) 1-9條/l0視野(3+) 1-9條/每視野(4+) 到達(dá)或超越10條/每視野報(bào)告1+至少察看300視野，2+至少察看100視野，3+以上至少50個(gè)視野熒光法鏡檢結(jié)果報(bào)告規(guī)范陰性 未發(fā)現(xiàn)抗酸菌/50視野報(bào)告實(shí)踐菌落數(shù) 1-9條/50視野(1+) 10-49條/50視野(2+) 1-9條/每視野(3+) 10-99條/每視野(4+) 到達(dá)或超越100條/每視野報(bào)告2+至少察看50視野，3+以上至少20個(gè)視野分枝桿菌培育操作步驟對(duì)照標(biāo)志的患者姓名，在生物平安柜內(nèi)將約2ml痰標(biāo)本置于相應(yīng)的前處置管中；運(yùn)用吸管，將與痰標(biāo)本等體積4%NaOH參與前處置管中；旋緊處置管螺旋蓋，接通渦旋振蕩器電源，將處置管在渦旋振蕩器上渦旋震蕩30秒左右；假設(shè)以手持拿處置管，持拿方法是以拇指、無(wú)名指分別持拿處置管外壁，食指、中指按處置管螺旋蓋。操作步驟將前處置管置于試管架內(nèi)，置于生物平安柜內(nèi)，室溫靜置15分鐘；擰開(kāi)羅氏培育管螺旋蓋，檢查培育基斜面底部的凝固水，假設(shè)凝固水過(guò)多，那么沿著斜面相對(duì)的一面的培育管內(nèi)壁，將凝固水棄去。以無(wú)菌吸管汲取前處置后的痰標(biāo)本，汲取時(shí)汲取的程度要小于擠壓的程度，使吸管前端一段不含液體，防止液體不測(cè)滴落。操作步驟堅(jiān)持培育基斜面程度或底端略高，均勻接種至酸性羅氏培育基斜面上，每支培育基運(yùn)用接種2滴〔約0.1-0.15ml〕，接種時(shí)第一滴液體接種至斜面中部，第二滴接種到培育基上部；將用過(guò)的吸管置于廢液缸內(nèi)；旋上培育管螺旋蓋，不要太緊；悄然轉(zhuǎn)動(dòng)并放低培育管底部，使接種的液體均勻的在斜面上鋪開(kāi)。培育基置于恒溫培育箱內(nèi)，36±1℃孵育；操作

痰標(biāo)本1－2倍4%NaOH振蕩勻化靜置15分鐘

37℃豎直培育8周均勻接種0.1ml,2支/標(biāo)本斜面向上，37℃程度放置24小時(shí)接種和孵育培育流程圖

渦旋振蕩1-2分鐘痰標(biāo)本中參與1-2倍體積4%NaOH分別接種0.1ml前處置液至2只培育基斜面接種后3天、7天察看，以后每周察看一次置37℃溫箱培育有菌落生長(zhǎng)需經(jīng)抗酸染色確認(rèn)，至第8周無(wú)菌落生長(zhǎng)報(bào)告陰性室溫靜置15分鐘4325671登記與報(bào)告

接種后第3和7日察看培育情況，以后每周察看一次，直至第八周末。每次察看后要在培育結(jié)果記錄本上記錄察看結(jié)果。無(wú)菌落生長(zhǎng)報(bào)告培育陰性菌落生長(zhǎng)不及斜面面積1/4時(shí)報(bào)告實(shí)踐菌落數(shù)菌落占斜面面積1/4報(bào)告(1+)菌落占斜面面積1/2報(bào)告(2+)菌落占斜面面積3/4報(bào)告(3+)菌落布滿培育基斜面報(bào)告(4+)初步斷定、報(bào)告以藥物敏感性測(cè)試為目的〔包括耐藥性診斷和耐藥監(jiān)測(cè)等〕，不需求對(duì)培育物進(jìn)展涂片檢查，只需將培育物送至進(jìn)展藥物敏感性測(cè)試的實(shí)驗(yàn)室，并附培育物生長(zhǎng)情況的報(bào)告單。以培育作為診斷或評(píng)價(jià)療效為目的，需求對(duì)培育物進(jìn)展涂片顯微鏡檢查、鑒定，根據(jù)涂片和鑒定結(jié)果進(jìn)展報(bào)告。培育物經(jīng)涂片顯微鏡檢查確定為抗酸菌后，結(jié)合菌落形狀、生長(zhǎng)時(shí)間，報(bào)告：羅氏培育抗酸菌陽(yáng)性經(jīng)菌種初步鑒定，證明為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群后，報(bào)告：羅氏培育結(jié)核菌陽(yáng)性菌落形狀1、幼稚菌落比較小，外表光滑而有光澤呈黃色；成熟典型菌普通為中等大小或較大，枯燥粗糙，易碎，呈奶酪色，白色或橘黃色，不透明凸起菌落。2、不典型菌落為細(xì)小、園形、潮濕、易乳化、呈黃紅色，普通7-10天內(nèi)就成熟，常為非典型抗酸桿菌或非致病菌。假設(shè)發(fā)現(xiàn)培育基污染，按污染面積報(bào)告污染菌有明顯界限，且不超越斜面面積1/4報(bào)告(C1+)污染菌有明顯界限，且不超越斜面面積1/2報(bào)告(C2+)污染菌有明顯界限，且不超越斜面面積3/4報(bào)告(C3+)污染菌沒(méi)有明顯界限或布滿培育基斜面報(bào)告(C4+)

本卷須知留取標(biāo)本后，盡能夠立刻進(jìn)展培育。假設(shè)不能立刻處置，應(yīng)冷藏；將氫氧化鈉分裝成假設(shè)干小瓶〔小包裝〕，每次運(yùn)用新的氫氧化鈉；假設(shè)只需一臺(tái)生物平安柜，防止同時(shí)進(jìn)展涂片和培育操作；在同一批處置的痰標(biāo)本中，優(yōu)先處置涂片陰性的標(biāo)本，其次處置陽(yáng)性級(jí)別低的標(biāo)本，最后處置涂片陽(yáng)性級(jí)別高的標(biāo)本翻開(kāi)標(biāo)本容器蓋子時(shí)要緩慢以減少氣溶膠的產(chǎn)生，同時(shí)防止猛烈震蕩標(biāo)本，震蕩后靜置幾分鐘，然后再翻開(kāi)蓋子本卷須知處置標(biāo)本時(shí)，盡能夠隨時(shí)蓋上容器蓋子，防止在生物平安柜內(nèi)敞開(kāi)一切的標(biāo)本容器用過(guò)的無(wú)菌吸管應(yīng)置于廢液缸中；正確標(biāo)志培育管防止標(biāo)本之間混淆；控制前處置去污染的接觸時(shí)間，從向標(biāo)本中參與氫氧化鈉到接種時(shí)間不能超越20分鐘，為此，當(dāng)標(biāo)本數(shù)量較多時(shí)，應(yīng)分批處置，每批標(biāo)本數(shù)量不超越6份為宜；本卷須知應(yīng)將培育結(jié)果及時(shí)反響給臨床醫(yī)生。7天以內(nèi)的結(jié)果察看中假設(shè)發(fā)現(xiàn)污染，應(yīng)告知病人及時(shí)搜集另一份標(biāo)本；假設(shè)發(fā)現(xiàn)快速生長(zhǎng)分枝桿菌〔7天內(nèi)長(zhǎng)出的菌落〕。立刻報(bào)告結(jié)果并要求再搜集另一份痰標(biāo)本。結(jié)核菌能夠在3-4周內(nèi)生長(zhǎng)。發(fā)現(xiàn)菌落并鑒定后立刻報(bào)告結(jié)果。報(bào)告陰性培育結(jié)果時(shí)應(yīng)孵育滿8周。登記內(nèi)容應(yīng)包括：菌落初生長(zhǎng)的日期以及陽(yáng)性培育物的菌落特征;污染結(jié)果應(yīng)隨時(shí)檢出并報(bào)告。常用的評(píng)價(jià)目的涂陽(yáng)培陰率=培育陰性的病例總數(shù)/涂片檢查陽(yáng)性的病例總數(shù)*100%涂陽(yáng)培陰率應(yīng)<10%污染率=污染的培育管數(shù)量/培育管總數(shù)*100%污染率應(yīng)<5%可能原因解決方法標(biāo)本保存不當(dāng)(時(shí)間、溫度）標(biāo)本留取后盡快培養(yǎng)，暫時(shí)無(wú)法培養(yǎng)應(yīng)于4C冰箱保存。標(biāo)本選擇不當(dāng)選擇標(biāo)本中膿樣、干酪樣可疑部分過(guò)處理（時(shí)間、濃度)4％NaOH，1－2倍體積，20分鐘接種量太小每管接種0.1毫升溫箱溫度不當(dāng)溫箱內(nèi)置溫度計(jì)，每日監(jiān)測(cè)溫度。涂陽(yáng)培陰率過(guò)高？可能原因解決方法標(biāo)本保存不當(dāng)(時(shí)間、溫度）標(biāo)本留取后盡快培養(yǎng)，暫時(shí)無(wú)法培養(yǎng)應(yīng)于4C冰箱保存。前處理不充分4％，1－2倍，充分混旋，20分鐘。材料滅菌不佳接種用吸管需高壓滅菌。操作不當(dāng)培訓(xùn)，預(yù)培養(yǎng)，嚴(yán)格按操作規(guī)程操作。培養(yǎng)基因素統(tǒng)一供應(yīng)，4C直立保存，1個(gè)月內(nèi)使用污染率過(guò)高？藥敏實(shí)驗(yàn)?zāi)康模褐委?，監(jiān)測(cè)，診斷耐藥主要就是診斷耐藥結(jié)核病、選擇和調(diào)整耐藥結(jié)核病治療方案、開(kāi)展耐藥監(jiān)測(cè)以了解某一地域結(jié)核分枝桿菌的耐藥程度。比例法Canetti,1963臨界藥物濃度〔單和多藥物濃度〕臨界菌群比＝耐藥菌群數(shù)/全菌群數(shù)1%、10%…絕對(duì)濃度法Meisnner，1963臨界藥物濃度〔單或多藥物濃度〕臨界藥物菌落數(shù)〔10、20菌落〕比率法Mitchson，1963RR=MIC被檢菌/MICH37Rv常見(jiàn)幾種法：比例法藥敏實(shí)驗(yàn)的根本步驟含藥培育基的制備菌液制備和稀釋接種培育報(bào)告結(jié)果推薦濃度（ug/ml)藥物L(fēng)J*7H107H11Bactec460MGIT960異煙肼0.20.20.20.10.1利福平40.01.01.02.01.0乙胺丁醇2.05.07.52.55.0鏈霉素4.02.02.02.01.0吡嗪酰胺

NRNRNR100.0100.0卡那霉素30.05.06.04.0阿米卡星401.01.0卷須霉素

4010.010.01.252.5環(huán)丙沙星3.02.02.02.01.0氧氟沙星2.02.02.02.02.0莫西沙星0.50.25加替沙星1.0乙硫異煙胺5.010.02.55.0丙硫異煙胺40.01.252.5PAS1.02.08.02.0環(huán)絲氨酸40NRNRNRNR氨硫脲NRNRNRNRNR利奈唑胺1.01.0WHO引薦的DST培育基藥物濃度(2007)藥敏實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前物品預(yù)備一切實(shí)驗(yàn)用品必需無(wú)菌一切用品一次性拿入實(shí)驗(yàn)室，不要在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中反復(fù)進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)菌株的預(yù)備一、臨床標(biāo)本初分別的菌株，假設(shè)具備以下特點(diǎn)，可直接用于藥敏實(shí)驗(yàn)：1、出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)菌落后1－2周的新穎菌落。2、沒(méi)有其他污染菌共存。3、涂片確以為抗酸菌二、以下情況需求二次傳代后才干進(jìn)展藥敏實(shí)驗(yàn)：1、固體培育基上生長(zhǎng)老化的菌落。2、固體培育基上部分污染的菌落。藥敏實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)人員的平安防護(hù)：分枝桿菌藥敏實(shí)驗(yàn)是對(duì)高致病性病原微生物的純分別培育物進(jìn)展操作，實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)入藥敏實(shí)驗(yàn)區(qū)須穿防護(hù)服、鞋套，實(shí)驗(yàn)中須戴手套、帽子、N95口罩。菌懸液制備預(yù)備磨菌瓶或磨菌管：磨菌瓶為帶有可密封螺旋蓋的玻璃小瓶，裝入約10個(gè)直徑3mm的玻璃珠，高壓滅菌后待用。磨菌管為底部磨砂的玻璃管，帶有與之匹配的磨砂玻璃棰〔磨菌棒〕，分別高壓后方可可運(yùn)用。菌懸液制備磨菌瓶法：在磨菌瓶中參與1~2滴10%吐溫-80，用火焰消毒的接種環(huán)刮取2-3周的新穎菌落，置于磨菌瓶中。留意盡能夠刮取多處的菌落。旋緊瓶蓋，在渦旋振蕩器上混旋0.5-1分鐘。參與少許滅菌的PBS或生理鹽水。將懸濁液轉(zhuǎn)移至比濁管中，加生理鹽水或PBS其濁度與規(guī)范麥?zhǔn)媳葷峁堋睲acFarlandNo.1〕一致，即得到1mg/ml的菌液。菌懸液制備磨菌管法向磨菌管中參與1滴10%吐溫-80，用火焰消毒的接種環(huán)刮取2-3周的新穎菌落，放入玻璃磨菌器底部，插入磨菌棒捻動(dòng)，使呈乳酪樣，參與少許滅菌PBS緩沖液或生理鹽水，靜止片刻，吸適量〔1-2ml〕至比濁管中，參與生理鹽水直至其濁度與規(guī)范麥?zhǔn)媳葷峁堋睲acFarlandNo.1〕一致，即為1mg/ml的菌液。取菌磨菌菌液稀釋每株菌事先預(yù)備好2個(gè)稀釋管，然后用22SWG規(guī)范接種環(huán)或微量吸管汲取比濁好的菌液，無(wú)菌操作逐漸稀釋至10-2mg/ml和10-4mg/ml。22SWG規(guī)范接種環(huán)：金屬絲直徑0.7mm，接種環(huán)內(nèi)徑3mm，1滿環(huán)移液0.01ml。接種及培育用22SWG規(guī)范接種環(huán)分別沾取1環(huán)〔即0.01ml〕10-2mg/ml和10-4mg/ml的菌液，用劃線法均勻接種至對(duì)照及含藥培育基外表，應(yīng)留意使菌液盡能夠均勻分散于培育基斜面。最終接種菌量為10-4mg和10-6mg。接種后的培育基置于37℃培育，至周圍后報(bào)告結(jié)果。取菌液結(jié)果報(bào)告按以下方式記錄菌落生長(zhǎng)情況：少于50個(gè)菌落：實(shí)踐菌落數(shù)50-100個(gè)菌落：1+100-200個(gè)菌落：2+大部分交融〔200-500個(gè)菌落〕：3+交融〔大于500個(gè)菌落〕：4+4周后察看結(jié)果，假設(shè)生長(zhǎng)不良，可適當(dāng)延伸但不能超越6周報(bào)告結(jié)果.〔耐藥菌長(zhǎng)的慢，藥效喪失〕

結(jié)果計(jì)算計(jì)算耐藥百分比：含藥培育基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)耐藥百分比=--------------------------×100%對(duì)照培育基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)假設(shè)耐藥百分比大于或等于1%，那么以為受試菌對(duì)該抗結(jié)核藥耐藥。

結(jié)果記錄方式對(duì)照SMINHEMBRFPKANOFX病人編號(hào)－4－6最終判斷S/R菌濃度藥物練習(xí)培養(yǎng)基菌濃度10－2菌濃度10－4耐藥百分比（100％）對(duì)照4+50SM3+25？INH1+9？EMB20？RFP4+45？藥敏接種預(yù)備質(zhì)量控制假設(shè)高稀釋度菌液〔10-4mg/ml〕在對(duì)照培育基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)少于20個(gè)菌落，那么應(yīng)從對(duì)看管傳代培育，反復(fù)實(shí)驗(yàn)。每批實(shí)驗(yàn)以結(jié)核分枝桿菌參考菌株〔H37Rv敏感株〕檢測(cè)含藥培育基的質(zhì)量。本卷須知培育基制備－藥物效價(jià)、保管與運(yùn)用期限選擇新穎、生長(zhǎng)旺盛的菌落進(jìn)展藥敏實(shí)驗(yàn)，生長(zhǎng)不良或陳舊菌株應(yīng)傳代后再進(jìn)展實(shí)驗(yàn)比濁、菌液稀釋應(yīng)力求準(zhǔn)確，以保證接種菌量的準(zhǔn)確。以下操作應(yīng)嚴(yán)厲按技術(shù)規(guī)范進(jìn)展，防止產(chǎn)生氣溶膠：挑取菌落、磨菌、菌液稀釋和接種、燒灼接種環(huán)。實(shí)驗(yàn)后按要求處置廢棄物和實(shí)驗(yàn)物品。比例法藥敏實(shí)驗(yàn)流程對(duì)照培育基含藥培育基藥物儲(chǔ)存液混合、搖勻根底液改良L-J100ml1ml磨菌分裝凝固分裝凝固1mg/ml菌懸液10-4mg/ml10-2mg/ml100倍稀釋100倍稀釋接種0.01ml接種0.01ml2-3周新穎菌落凍存分支桿菌的菌種鑒定〔初篩〕根據(jù)分支桿菌在一些特定培育基上能否生長(zhǎng)的特性，將其初步鑒定為人型結(jié)核分支桿菌、牛型結(jié)核分支桿菌和非典型分支桿菌。主要的培育基為PNB〔對(duì)硝基苯甲酸〕、TCH〔噻吩-2-羥酸肼〕培育基接種方法：用22SWG規(guī)范接種環(huán)沾取1環(huán)10-1mg/ml的菌液〔即0.01ml〕，用劃線法均勻接種至PNB、TCH培育基外表，每管最終接種菌量為10-3mg/管。接種后的培育基置于37℃培育，至周圍后報(bào)告結(jié)果。結(jié)果判別對(duì)照培養(yǎng)基PNBTCH人型+_+牛型+__非典型+++我國(guó)目前正在評(píng)價(jià)的新診斷技術(shù)衛(wèi)生部-----蓋茨基金會(huì)工程新診斷技術(shù)項(xiàng)目省地市級(jí)縣級(jí)國(guó)家級(jí)二極管發(fā)光顯微鏡(LED)3----61等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)1----21線性探針(LPA)44-----1基因芯片(Genechip)4-----1多色巢式定量PCR(GenXpert)44-----1我國(guó)目前正在評(píng)價(jià)的新診斷技術(shù)衛(wèi)生部----梅里?；饡?huì)工程新診斷技術(shù)項(xiàng)目省地市級(jí)縣級(jí)國(guó)家級(jí)二極管發(fā)光顯微鏡2----2等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)2----2線性探針2----2液體培養(yǎng)2----2r干擾素釋放試驗(yàn)2基因分型11我國(guó)目前正在評(píng)價(jià)的新診斷技術(shù)實(shí)驗(yàn)方法醫(yī)院數(shù)量MIGT960液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)的比較5衛(wèi)生部----碧迪公司工程新方法用途LED(發(fā)光二極管顯微鏡)涂片檢查L(zhǎng)AMP(等溫?cái)U(kuò)增)涂陰\涂陽(yáng)LPA(線性探針)MDR-TB,鑒定Genechip(基因芯片)MDR-TB,鑒定GeneXpert(多色巢式定量PCR)耐RFP,涂片陰性診斷涂片檢查：LED熒光顯微鏡發(fā)光二極管〔LED〕熒光顯微鏡光源壽命長(zhǎng)〔30,000h〕不需求預(yù)熱不需求暗室可用現(xiàn)有的顯微鏡可運(yùn)用電池電源與通常熒光顯微鏡的斷定一致率98.0%〔n=1,326/內(nèi)部資料〕FraenFluoLEDmodule兩種方法察看結(jié)果Z-N染色鏡檢結(jié)果LED鏡檢結(jié)果中蓋工程LED評(píng)價(jià)結(jié)果初診患者LED涂陽(yáng)患者檢出率為14.96%〔552/3691〕，萋尼氏染色明場(chǎng)顯微鏡涂陽(yáng)患者檢出率12.46%(460/3691)，前者較后者提高2.5個(gè)百分點(diǎn)〔P=0.000〕隨訪患者LED和明場(chǎng)顯微鏡的檢出率分別為7.09%(178/2509)和2.83%〔71/2509)，提高4.26個(gè)百分點(diǎn)〔P=0.000〕中蓋工程LED評(píng)價(jià)結(jié)果讀片時(shí)間LED讀片時(shí)間120.03±38.88秒，明場(chǎng)顯微鏡206.31±75.86秒〔p=0.00〕運(yùn)用接受度調(diào)查對(duì)于進(jìn)一步推行建議，大多數(shù)(8/9)以為應(yīng)進(jìn)一步推行，但其中有2人以為應(yīng)在日任務(wù)量大的實(shí)驗(yàn)室優(yōu)先運(yùn)用線性探針檢測(cè)技術(shù)可檢測(cè)能否感染結(jié)核桿菌可同時(shí)檢測(cè)患者能否對(duì)利福平和異煙肼耐藥約五小時(shí)內(nèi)即可得到檢測(cè)結(jié)果操作步驟檢測(cè)步驟DNA提取：1~1.5hPCR擴(kuò)增：2.5~3h探針雜交：2~2.5h結(jié)果判讀：0.5h耐藥分子診斷的根本原理利福平/異煙肼耐藥性的產(chǎn)生與結(jié)核分枝桿菌特定基因某些位點(diǎn)的突變相關(guān)?？菇Y(jié)核藥基因基因功能利福平rpoB編碼DNA依賴RNA聚合酶，參與mRNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程異煙肼katG編碼過(guò)氧化氫-過(guò)氧化物酶，參與INH體內(nèi)的轉(zhuǎn)化inhA編碼煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)依賴的enoyl-ACP還原酶，參與脂酸的合成

中蓋工程線性探針檢測(cè)利福平評(píng)價(jià)

利福平線性探針傳統(tǒng)藥敏合計(jì)一致率靈敏度特異性PPV陽(yáng)性預(yù)測(cè)值NPV陰性預(yù)測(cè)值耐藥敏感合計(jì)耐藥1354117693.6%75.0%96.5%76.7%96.2%敏感4511271172合/p>

中蓋工程線性探針檢測(cè)異煙肼評(píng)價(jià)

異煙肼線性探針傳統(tǒng)藥敏總計(jì)一致率靈敏度特異性PPVNPV耐藥敏感合計(jì)耐藥1493017993.2%71.0%97.4%83.2%94.8%敏感6111081169合計(jì)21011381348

中蓋工程線性探針檢測(cè)MDR評(píng)價(jià)

MDR線性探針傳統(tǒng)合計(jì)一致率靈敏度特異性PPVNPVMDR非-MDR合計(jì)MDR792810795.0%66.4%97.7%73.8%96.8%非-MDR4012011241合計(jì)11912291348結(jié)核耐藥檢測(cè)基因芯片激光共焦掃描儀軟件判讀結(jié)核耐藥檢測(cè)芯片獲北京市自主創(chuàng)新產(chǎn)品證書(shū)樣品制備儀雜交儀通量：兩個(gè)一線抗結(jié)核藥速度：6小時(shí)〔比傳統(tǒng)藥敏實(shí)驗(yàn)法快50-100倍〕靈敏度：103CFU/反響特異性：對(duì)照設(shè)計(jì)嚴(yán)謹(jǐn)；自動(dòng)判讀基于rpoB/katG/inhA的基因突變，快速檢測(cè)分別株或者痰樣本中結(jié)核桿菌多藥耐藥〔利福平、異煙肼〕。InternationalJournalofTuberculosisandLungDisease,13:914-920,2021〔IF=2.3〕96獲國(guó)家醫(yī)療器械證書(shū)和歐盟CE認(rèn)證基因芯片基因芯片是指采用光導(dǎo)原位合成或微量點(diǎn)樣等方法，將核酸片段有序地固化于支持物的外表，然后與已標(biāo)志的待測(cè)生物樣品中靶分子雜交，經(jīng)過(guò)特定的儀器對(duì)雜交信號(hào)的強(qiáng)度進(jìn)展快速、并行、高效地檢測(cè)分析，從而判別樣品中靶分子的數(shù)量。檢測(cè)過(guò)程雜交反響雜交清洗清洗枯燥掃描檢測(cè)數(shù)據(jù)分析檢測(cè)分析PCR擴(kuò)增DNA提取樣品制備芯片結(jié)果圖例芯片雜交質(zhì)控芯片制備質(zhì)控芯片制備質(zhì)控芯片雜交質(zhì)控靶基因擴(kuò)增質(zhì)控陰性對(duì)照質(zhì)控空白對(duì)照質(zhì)控產(chǎn)品指標(biāo)基因芯片線性探針注冊(cè)證書(shū)SFDA、CESFDA、CE產(chǎn)地中國(guó)德國(guó)用途從涂片陽(yáng)性痰標(biāo)本或培養(yǎng)物中檢測(cè)對(duì)利福平和異煙肼的耐藥性從涂片陽(yáng)性痰標(biāo)本或培養(yǎng)物中檢測(cè)分枝桿菌對(duì)利福平和異煙肼的耐藥性檢測(cè)原理耐藥相關(guān)基因的突變耐藥相關(guān)基因的突變（參考國(guó)際文獻(xiàn)）檢測(cè)方法反向雜交（斑點(diǎn)）反向雜交（slot\縫隙）需要儀器核酸提取儀、基因擴(kuò)增儀、芯片雜交儀、芯片洗干儀和掃描儀超聲水浴、基因擴(kuò)增儀、雜交儀試劑儲(chǔ)藏4℃和-20℃4℃和-20℃檢測(cè)指標(biāo)M.tb+16NTM種/群M.tb+13NTM種/群可擴(kuò)展性強(qiáng)弱內(nèi)部質(zhì)控5種3種靈敏度102-103菌/ml[JCM,inrevision]

102-103菌/ml[JCM,2002]符合率三家醫(yī)院，1724例，測(cè)序符合率100%分離株(157株)[JCM2008],(197株)[JCM2006],(219株)[CMI2006]。符合率分別為100%,,98.9%和88%

探針重復(fù)5次1次檢測(cè)重復(fù)性10次重復(fù)，結(jié)果均正確無(wú)相關(guān)資料其他樣本痰標(biāo)本、分離株痰標(biāo)本、分離株操作流程自動(dòng)化高（雜交-清洗-掃描），省力，通量高，重復(fù)性好自動(dòng)化低（雜交），費(fèi)力，通量低，重復(fù)性稍差結(jié)果判讀儀器掃描，軟件自動(dòng)判讀雜交顯示條帶需黏貼比對(duì)，肉眼或自動(dòng)判讀，。成本相當(dāng)（根據(jù)兩家的市場(chǎng)價(jià)格和在疾病預(yù)防控制體系中應(yīng)用的承諾價(jià)格）環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)可同時(shí)檢測(cè)患者能否感染結(jié)核對(duì)涂陰培陽(yáng)病人具有非常高的敏感性和特異性兩小時(shí)內(nèi)即可得到檢測(cè)結(jié)果，所用儀器設(shè)備極其簡(jiǎn)單PCRLAMP?需求運(yùn)用PCR擴(kuò)增儀?針對(duì)基因設(shè)計(jì)的特異性的兩條引物?擴(kuò)增效率:107?不需求運(yùn)用PCR擴(kuò)增儀?多對(duì)引物保證了擴(kuò)增的特異性?擴(kuò)增效率:1010擴(kuò)增原理操作流程抽提基因組DNA擴(kuò)增管去除雜質(zhì)將純真DNA轉(zhuǎn)入擴(kuò)增管痰血液咽試子標(biāo)本類型樣品處置在幾分鐘內(nèi)就可以完成＋－Genexpert檢測(cè)技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)患