酵母細胞自噬與蛋白質(zhì)結(jié)合

第三組匯報1一、實驗基礎(chǔ)二、實驗思路四、實驗結(jié)果三、實驗過程2實驗基礎(chǔ)轉(zhuǎn)染：將具生物功能的核酸轉(zhuǎn)移或運送到細胞內(nèi)并使核酸在細胞內(nèi)維持其生物功能。

基因轉(zhuǎn)染技術(shù)：將純化的含有靶基因的質(zhì)粒DNA送入細胞內(nèi)，并在細胞內(nèi)表達。3實驗基礎(chǔ)4實驗基礎(chǔ)免疫印跡法經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。51975年，Southern建立了將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質(zhì)進行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。6實驗基礎(chǔ)啤酒酵母細胞自噬所必須的蛋白結(jié)合系統(tǒng)修飾蛋白Apg12p的末端甘氨酸通過異肽腱被連接在Apg5p賴氨酸殘基上，由Apg7p介導的人類細胞7實驗過程hApg12，這是一個140個氨基酸的蛋白質(zhì)，和酵母Apg12具有27%的一致性，具有48%的相似性8實驗思路hApg12與hApg5在人類細胞中共價結(jié)合hApg12的c末端甘氨酸是結(jié)合做必須的hApg5賴氨酸-149是Apg12p結(jié)合的受體點

9實驗過程Northern印跡法10hApg12轉(zhuǎn)錄物在所有組織的檢查被發(fā)現(xiàn),包括心臟、腦、胎盤、肺、肝臟、骨骼肌、腎癌、胰腺癌,，表明hApg12mRNA廣泛表達11121314泛素化是蛋白修飾系統(tǒng)Apg7pandApg10p，需要用于結(jié)合，Apg7p展示著泛素活化酶（E1）一類的同源性，Apg10p可能是一個泛素結(jié)合酶(E2)，因此至少四個蛋白質(zhì)(Apg5p,-7p,-10p,and-12p)在蛋白結(jié)合體系中發(fā)揮作用，當它們?nèi)我庖粋€基因有缺陷自噬都無法進行雖然Apg12p結(jié)合系統(tǒng)類似于泛素化，Apg12p的氨基酸序列明顯與泛素不同，考慮到其他發(fā)現(xiàn)的修飾蛋白是泛素化，Apg12p是第一個與泛素無關(guān)的蛋白修飾。實驗討論15盡管Apg12系統(tǒng)與泛素化修飾系統(tǒng)相似，但是人類和酵母菌的Apg12比較大且沒有泛素化的同源性。Apg12看起來有一個單一的靶蛋白，Apg5hApg12系統(tǒng)不是泛素化修飾實驗討論16實驗討論依舊無法證明酵母細胞中這個蛋白結(jié)合系統(tǒng)在自噬的哪一步行使功能，我們推測它的功能與自噬體的形成有關(guān)。i.在apg5,apg7,apg10和apg12突變株中沒有發(fā)現(xiàn)自噬現(xiàn)象；ii.在酵母細胞中大多數(shù)的Apg12p,Apg5p,andApg12p/Apg5p在膜片段上存在；iii.在發(fā)生蛋白結(jié)合后，Apg12p的位置發(fā)生變化，在轉(zhuǎn)染實驗中，大約一半以上的hApg12和hApg5大量表達時，會在膜片段上檢測到。