高二生物寒假講義練習(xí)（選擇性必修3）第07講 重組DNA技術(shù)的基本工具（學(xué)生卷）

第07講重組DNA技術(shù)的基本工具【學(xué)習(xí)目標(biāo)】1.闡明重組DNA技術(shù)所需的三種工具的作用。2.提升對(duì)基因工程的理解能力，能夠合理分析在基因水平產(chǎn)生的問(wèn)題。3.了解進(jìn)行DNA的粗提取和鑒定的原理，進(jìn)行DNA的粗提取和鑒定的操作。3.認(rèn)同基因工程的作用及意義，認(rèn)識(shí)到生物技術(shù)的發(fā)展離不開(kāi)理論研究和技術(shù)創(chuàng)新。【基礎(chǔ)知識(shí)】一、基因工程的概念項(xiàng)目具體內(nèi)容操作對(duì)象基因原理基因重組操作環(huán)境體外操作水平分子水平結(jié)果獲得人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品優(yōu)點(diǎn)克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙;定向改造生物的性狀二、限制性核酸內(nèi)切酶（1）來(lái)源：主要從原核生物中分離出來(lái)。（2）種類：約4000種（3）作用:識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開(kāi)。（4）限制酶識(shí)別序列的長(zhǎng)度最常見(jiàn)的為6個(gè)核苷酸，也有少數(shù)限制酶的識(shí)別序列由4個(gè)、8個(gè)、或其他數(shù)量的核苷酸組成。①在中軸線兩側(cè)切割，形成黏性末端。如：EcoRI限制酶能識(shí)別GAATTC序列，為6個(gè)核苷酸，并在G和A之間切開(kāi)。②在中軸線處切割，形成平末端。如：SmaI限制酶能識(shí)別CCCGGG序列，為6個(gè)核苷酸，并在G和C之間切開(kāi)?？偨Y(jié)歸納1.限制性核酸內(nèi)切酶是可以識(shí)別并附著特定的\t"/item/%E9%99%90%E5%88%B6%E6%80%A7%E6%A0%B8%E9%85%B8%E5%86%85%E5%88%87%E9%85%B6/_blank"核苷酸序列，并對(duì)每條鏈中特定部位的兩個(gè)脫氧核糖核苷酸之間的\t"/item/%E9%99%90%E5%88%B6%E6%80%A7%E6%A0%B8%E9%85%B8%E5%86%85%E5%88%87%E9%85%B6/_blank"磷酸二酯鍵進(jìn)行切割的一類酶，簡(jiǎn)稱限制酶。2.限制作用實(shí)際就是限制酶降解\t"/item/%E9%99%90%E5%88%B6%E6%80%A7%E6%A0%B8%E9%85%B8%E5%86%85%E5%88%87%E9%85%B6/_blank"外源DNA，維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制。一般不切割自身的DNA分子，是由于甲基化的修飾作用，可使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化而受到保護(hù)，通過(guò)\t"/item/%E9%99%90%E5%88%B6%E6%80%A7%E6%A0%B8%E9%85%B8%E5%86%85%E5%88%87%E9%85%B6/_blank"甲基化作用達(dá)到識(shí)別自身遺傳物質(zhì)和外來(lái)遺傳物質(zhì)的目的。3.根據(jù)酶的功能特性、大小及反應(yīng)時(shí)所需的輔助因子，限制性內(nèi)切酶可分為兩大類，即I類酶和Ⅱ類酶。其中，Ⅱ類酶有EcoRI、BamHI、HindⅡ、HindⅢ等，在所識(shí)別的特定\t"/item/%E9%99%90%E5%88%B6%E6%80%A7%E6%A0%B8%E9%85%B8%E5%86%85%E5%88%87%E9%85%B6/_blank"堿基序列上有特定的酶切位點(diǎn)，因而DNA分子經(jīng)過(guò)Ⅱ類酶作用后，可產(chǎn)生特異性的酶解片斷，這些片斷可用凝膠\t"/item/%E9%99%90%E5%88%B6%E6%80%A7%E6%A0%B8%E9%85%B8%E5%86%85%E5%88%87%E9%85%B6/_blank"電泳法進(jìn)行分離、鑒別。4.限制酶識(shí)別DNA序列中的回文序列?；匚男蛄兄傅氖请p鏈\t"/item/%E5%9B%9E%E6%96%87%E5%BA%8F%E5%88%97/_blank"DNA或\t"/item/%E5%9B%9E%E6%96%87%E5%BA%8F%E5%88%97/_blank"RNA分子中的特定的核苷酸片段，該片段在其中一條鏈上按5'到3'讀取的序列與其互補(bǔ)鏈上按相同的5'到3'讀取的序列一致。例如，DNA序列ACCTAGGT之所以是回文序列，是因?yàn)樗幕パa(bǔ)序列是TGGATCCA，而反向互補(bǔ)序列是ACCTAGGT，和其原來(lái)序列一致。有些限制酶的切割位點(diǎn)在回文的一側(cè)（如EcoRI、BamHI、Hind等），因而可形成粘性末端；另一些Ⅱ類酶如AluI、BsuRI、BalI、HalⅢ、HPaI、SmaI等，切割位點(diǎn)在回文序列中間，形成平末端。三、DNA連接酶(1)作用：將雙鏈DNA片段“縫合”起來(lái)，恢復(fù)被限制酶切開(kāi)的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。即把脫氧核糖和磷酸交替連接而構(gòu)成的DNA骨架上的缺口連接起來(lái)。(2)類型：歸納總結(jié)1.DNA連接酶分為兩大類:一類是利用ATP催化兩個(gè)核苷酸鏈之間形成磷酸二酯鍵的依賴\t"/item/DNA%E8%BF%9E%E6%8E%A5%E9%85%B6/_blank"ATP的DNA連接酶；另一類是利用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的能量催化兩個(gè)核苷酸鏈之間形成磷酸二酯鍵的依賴NAD+的DNA連接酶。DNA連接酶是通過(guò)催化形成磷酸二酯鍵把兩條DNA（雙股或是單股DNA）黏合成一條。2.教材中提到的E·coliDNA連接酶，來(lái)源于\t"/item/DNA%E8%BF%9E%E6%8E%A5%E9%85%B6/_blank"大腸桿菌，可用于連接\t"/item/DNA%E8%BF%9E%E6%8E%A5%E9%85%B6/_blank"粘性末端；\t"/item/DNA%E8%BF%9E%E6%8E%A5%E9%85%B6/_blank"T4DNA連接酶，來(lái)源于T4噬菌體，可用于連接粘性末端和平末端，但連接效率低。E·coliDNA連接酶對(duì)胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片段仍具有部分活性，可以催化酶與NAD(而不是ATP)反應(yīng)形成酶-AMP中間物，但不能繼續(xù)將AMP轉(zhuǎn)移到DNA上促進(jìn)磷酸二酯鍵的形成。T4DNA連接酶是ATP依賴的DNA連接酶，催化兩條DNA雙鏈上相鄰的5′磷酸基和3′\t"/item/DNA%E8%BF%9E%E6%8E%A5%E9%85%B6/_blank"羥基之間形成\t"/item/DNA%E8%BF%9E%E6%8E%A5%E9%85%B6/_blank"磷酸二酯鍵。四、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體（1）載體作用：將目的基因載入受體細(xì)胞。利用它在宿主細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行大量復(fù)制。（2）載體種類：質(zhì)粒、噬菌體、動(dòng)植物病毒等（3）最常用載體：質(zhì)粒特點(diǎn)：①裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA外，具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA。②有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn)。③在基因工程操作中，真正被用作載體的質(zhì)粒都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過(guò)人工改造的。④有特殊的標(biāo)記基因，如：抗生素的抗性基因（四環(huán)素抗性基因(tetr)、氨芐青霉素抗性基因(ampr)等）、熒光蛋白基因（綠色熒光蛋白基因(GFP)、紅色熒光蛋白基因(RFP)。⑤對(duì)細(xì)胞無(wú)毒無(wú)害。⑥大小適中，便于提取和操作。歸納總結(jié)1.基因工程中常用的運(yùn)載體主要有兩類：一類運(yùn)載體是噬菌體或某些病毒等。另一類是細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的\t"/item/%E8%BF%90%E8%BD%BD%E4%BD%93/_blank"質(zhì)粒，它是一種相對(duì)分子質(zhì)量較小、獨(dú)立于擬核之外的環(huán)狀DNA，有的一個(gè)細(xì)菌中有一個(gè)，有的一個(gè)細(xì)菌中有多個(gè)。質(zhì)粒能通過(guò)細(xì)菌間的接合由一個(gè)細(xì)菌向另一個(gè)細(xì)菌轉(zhuǎn)移，可以獨(dú)立復(fù)制，也可整合到細(xì)菌擬核DNA中，隨著擬核DNA的復(fù)制而復(fù)制。2.質(zhì)粒作為載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上為適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室操作而進(jìn)行人工構(gòu)建的質(zhì)粒。與天然質(zhì)粒相比，質(zhì)粒載體通常帶有一個(gè)或一個(gè)以上的標(biāo)記基因（如抗生素抗性基因）和一個(gè)人工合成的含有多個(gè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量盡可能減少，以便于基因工程操作。3.質(zhì)粒載體都有三個(gè)共同的特征：一個(gè)復(fù)制子、一個(gè)選擇性標(biāo)志和一個(gè)克隆位點(diǎn)。復(fù)制子是含有DNA復(fù)制起始位點(diǎn)的一段DNA，也包括表達(dá)由質(zhì)粒編碼的復(fù)制必需的RNA和蛋白質(zhì)的基因。克隆位點(diǎn)是\t"/item/%E8%B4%A8%E7%B2%92%E8%BD%BD%E4%BD%93/_blank"限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)，\t"/item/%E8%B4%A8%E7%B2%92%E8%BD%BD%E4%BD%93/_blank"外源性DNA可由此插入質(zhì)粒內(nèi)，而且并不影響質(zhì)粒的復(fù)制能力，或?yàn)樗拗魈峁┻x擇性表型。一般地，載體都含有多克隆位點(diǎn)，\t"/item/%E8%B4%A8%E7%B2%92%E8%BD%BD%E4%BD%93/_blank"多克隆位點(diǎn)的存在可以確保載體合適大部分的DNA片段，可以針對(duì)\t"/item/%E8%B4%A8%E7%B2%92%E8%BD%BD%E4%BD%93/_blank"插入片段提供特定的\t"/item/%E8%B4%A8%E7%B2%92%E8%BD%BD%E4%BD%93/_blank"酶切位點(diǎn)圖譜，防止插入片段插入不恰當(dāng)?shù)奈恢茫谫|(zhì)粒重組操作方面具有更大的靈活性。編碼抗生素抗性的基因是最普遍的細(xì)菌選擇性標(biāo)志（如pBR322）。主要的抗生素抗性基因有：\t"/item/%E8%B4%A8%E7%B2%92%E8%BD%BD%E4%BD%93/_blank"氨芐青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、四環(huán)素抗性基因和\t"/item/%E8%B4%A8%E7%B2%92%E8%BD%BD%E4%BD%93/_blank"卡那霉素抗性基因四種。五、DNA的粗提取和鑒定（一)提取生物大分子的基本思路選用一定的物理或化學(xué)方法分離具有不同物理或化學(xué)性質(zhì)的生物大分子。DNA粗提取的基本思路：利用DNA與RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等在物理和化學(xué)性質(zhì)方面的差異，提取DNA，去除其他成分。（二)提取DNA的基本原理1.DNA在NaCl中的的溶解性：在NaCl溶液濃度低于0.14mol/L時(shí)，DNA的溶解度隨NaCl溶液濃度的增加而逐漸降低；在0.14mol/L時(shí)，DNA溶解度最小；當(dāng)NaCl溶液濃度繼續(xù)增加時(shí)，DNA的溶解度又逐漸增大。當(dāng)氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為2mol/L時(shí)，DNA的溶解度最大；濃度為0.14mol/L時(shí)，DNA的溶解度最低。利用這一原理，可以使DNA在鹽溶液中溶解或析出。2.DNA對(duì)酶、高溫和洗滌劑的耐受性（1）對(duì)酶的耐受性：蛋白酶能水解蛋白質(zhì)，但對(duì)DNA沒(méi)有影響。（2）對(duì)溫度的耐受性：大多數(shù)蛋白質(zhì)不能忍受60～80℃的高溫，而DNA在80℃以上才會(huì)變性。（3）對(duì)洗滌劑的耐受性：洗滌劑能夠瓦解細(xì)胞膜，去除脂質(zhì)和蛋白質(zhì)但對(duì)DNA沒(méi)有影響。3.DNA在酒精溶液中的溶解性DNA不溶于酒精溶液，但細(xì)胞中某些蛋白質(zhì)則溶于酒精。將DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離。（三）DNA的鑒定沸水浴條件下，DNA遇二苯胺試劑呈現(xiàn)藍(lán)色歸納總結(jié)實(shí)驗(yàn)材料的選?。悍彩呛蠨NA的生物材料都可以考慮，但使用DNA含量相對(duì)較高的生物組織，成功的可能性更大。

2.破碎細(xì)胞，獲取含DNA的濾液

如果是動(dòng)物細(xì)胞，則破碎比較容易，以雞血細(xì)胞為例，在雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水，同時(shí)用玻璃棒攪拌，過(guò)濾后收集濾液即可。如果實(shí)驗(yàn)材料是植物細(xì)胞，需要先用洗滌劑溶解細(xì)胞膜。例如，提取洋蔥的DNA時(shí)，在切碎的洋蔥中加入一定的洗滌劑和食鹽，進(jìn)行充分的攪拌和研磨，過(guò)濾后收集研磨液。

3.去除濾液中的雜質(zhì)：

法一：DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同。當(dāng)氯化鈉的物質(zhì)的量濃度為2mol/L時(shí)，DNA的溶解度最大；濃度為0.14mol/L時(shí)，DNA的溶解度最低。利用這一原理，可以使DNA在鹽溶液中溶解或析出。法二：是蛋白酶分解蛋白質(zhì)，不分解DNA，從而使提取的DNA與蛋白質(zhì)分開(kāi)；法三：是DNA和蛋白質(zhì)對(duì)高溫耐受性的不同，從而使蛋白質(zhì)變性，與DNA分離。

【考點(diǎn)剖析】考點(diǎn)一：限制性內(nèi)切酶例1．圖甲表示某環(huán)型DNA分子經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶（EcoRⅠ）完全酶切后的片段電泳結(jié)果若改變條件使其酶切不充分就有可能獲得如圖乙所示的電泳結(jié)果（Kb即千個(gè)堿基對(duì)）。下列敘述錯(cuò)誤的是（

）A．該DNA分子全長(zhǎng)至少為7Kb，該DNA分子中至少含有4個(gè)EcoRⅠ酶切位點(diǎn)B．反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，得到圖甲結(jié)果的可能性越大C．限制性核酸內(nèi)切酶主要來(lái)自原核生物，化學(xué)本質(zhì)都是蛋白質(zhì)D．適當(dāng)增加EcoRⅠ濃度，更可能得到圖乙的結(jié)果【答案】D【解析】據(jù)題意和圖示分析可知：環(huán)型DNA分子經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶（EcoRⅠ）完全酶切后得到4.0、1.5、1.0和0.5四種長(zhǎng)度的DNA片段，說(shuō)明該DNA分子全長(zhǎng)至少為7Kb，至少含有4個(gè)EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)或適當(dāng)增加EcoRⅠ濃度，DNA被切割越徹底，得到圖甲結(jié)果的可能性越大。環(huán)型DNA分子經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶（EcoRⅠ）完全酶切后得到4.0、1.5、1.0和0.5四種長(zhǎng)度的DNA片段，說(shuō)明該DNA分子全長(zhǎng)至少為7Kb，環(huán)狀DNA分子，可以被限制性核酸內(nèi)切酶（EcoRⅠ）完全酶切后得到至少4個(gè)DNA片段，說(shuō)明該DNA分子中至少含有4個(gè)EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，故A正確；反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，DNA被切割越徹底，得到圖甲結(jié)果的可能性越大，故B正確；限制性核酸內(nèi)切酶主要來(lái)自原核生物，限制酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)，C正確；D、適當(dāng)增加EcoRⅠ濃度，可得到圖甲的結(jié)果，故D錯(cuò)誤?？键c(diǎn)二：DNA連接酶例2．限制酶和DNA連接酶是重組DNA技術(shù)常用的工具酶，限制酶通常將DNA分子切割成帶有黏性末端的DNA片段，而DNA連接酶可縫合帶有黏性末端的DNA片段。據(jù)圖分析錯(cuò)誤的是（

）A．圖示三個(gè)黏性末端一定由兩種不同的限制酶切割產(chǎn)生B．圖示中共有兩種黏性末端，其中甲與乙黏性末端相同C．a(chǎn)點(diǎn)核苷酸之間通過(guò)磷酸二酯鍵連接，b處核苷酸之間通過(guò)氫鍵連接D．催化甲形成的限制酶有可能不識(shí)別由甲、乙形成的重組DNA分子【答案】A【解析】限制酶能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷裂，形成黏性末端和平末端兩種；DNA連接酶連接的是兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵。切割產(chǎn)生甲的限制酶的識(shí)別列為：GAATTC//CTTAAG，切割產(chǎn)生乙的限制酶的識(shí)別列為：CAATTG//GTTAAC，切割產(chǎn)生丙的限制酶的識(shí)別序列為：CTTAAG//GAATTC，由此可見(jiàn)，甲、乙、丙的黏性末端是由三種限制酶催化產(chǎn)生的，A錯(cuò)誤；由圖可知，甲、乙的黏性末端相同，均為AATT—，丙的黏性末端為TTAA—，因此圖示中共有兩種黏性末端，B正確；a點(diǎn)屬于兩個(gè)核苷酸之間通過(guò)磷酸二酯鍵連接成鏈，b點(diǎn)屬于兩條鏈之間的核苷酸，通過(guò)氫鍵相連，C正確；切割甲的限制酶的識(shí)別列為：GAATTC//CTTAAG，而甲、乙片段形成的重組DNA分子序列為：GAATTG//CTTAAC，因此切割甲的限制酶不能識(shí)別由甲、乙片段形成的重組DNA分子，D正確?？键c(diǎn)三、基因工程的載體例3．質(zhì)粒是基因工程最常用的載體，下列有關(guān)質(zhì)粒的說(shuō)法正確的是（

）A．質(zhì)粒不僅存在于細(xì)菌中，也存在于某些病毒中 B．細(xì)菌的基因只存在于質(zhì)粒上C．質(zhì)粒為小型環(huán)狀DNA分子 D．質(zhì)粒是基因工程中的重要工具酶之一【答案】C【解析】基因工程常用的運(yùn)載體：質(zhì)粒、噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒。質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外并具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀DNA分子。質(zhì)粒主要存在于細(xì)菌、酵母菌等生物中，病毒中沒(méi)有質(zhì)粒，A錯(cuò)誤；細(xì)菌基因主要存在于擬核DNA上，也有少數(shù)存在于質(zhì)粒上，B錯(cuò)誤；質(zhì)粒為小型環(huán)狀DNA分子，存在于細(xì)胞核外或擬核外的細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，C正確；質(zhì)粒是基因工程中的重要工具之一，但不是工具酶，基因工程中的工具酶是限制酶和DNA聚合酶，D錯(cuò)誤?？键c(diǎn)四、DNA的粗提取和鑒定例4．如圖是“DNA粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)中的兩個(gè)操作步驟示意圖，相關(guān)敘述正確的是（）A.圖1中溶液a是0.14

mol?L-1的NaCl溶液

B.圖1所示操作的原理是DNA能溶于酒精，而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)不溶

C.圖2所示實(shí)驗(yàn)操作中有一處明顯錯(cuò)誤，可能導(dǎo)致試管2中藍(lán)色變化不明顯

D.圖2試管1的作用是證明2

mol?L-1

NaCl溶液遇二苯胺出現(xiàn)藍(lán)色【答案】C【解析】圖1中溶液a是2mol?L-1的NaCl溶液，A錯(cuò)誤；圖1所示操作的原理是DNA不能溶于酒精，而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)能溶，B錯(cuò)誤；圖2所示實(shí)驗(yàn)操作中有一處明顯錯(cuò)誤（試管2中未將DNA溶于2mol?L-1的NaCl溶液中），可能導(dǎo)致試管2中藍(lán)色變化不明顯，C正確；圖2試管1的作用是證明2

mol?L-1

NaCl溶液遇二苯胺不會(huì)出現(xiàn)藍(lán)色，D錯(cuò)誤。

【真題演練】1.(2021山東高考，13)粗提取DNA時(shí)，向雞血細(xì)胞液中加入一定量的蒸餾水并攪拌，過(guò)濾后所得濾液進(jìn)行下列處理后再進(jìn)行過(guò)濾，在得到的濾液中加入特定試劑后容易提取出DNA相對(duì)含量較高的白色絲狀物的處理方式是（）A.加入適量的木瓜蛋白酶B.37～40℃的水浴箱中保溫10～15分鐘C.加入與濾液體積相等的、體積分?jǐn)?shù)為95%的冷卻的酒精D.加入NaCl調(diào)節(jié)濃度至2mol/L→過(guò)濾→調(diào)節(jié)濾液中NaCl濃度至0．14mol/L2.（2020海南高考生物，10）下列關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述，錯(cuò)誤的是（）A.羊的成熟紅細(xì)胞可作為提取DNA的材料B.提取植物細(xì)胞的DNA時(shí)，需要加入一定量的洗滌劑和食鹽C.預(yù)冷的酒精溶液能抑制核酸水解酶活性，防止DNA水解D.在沸水浴條件下，DNA與二苯胺反應(yīng)呈現(xiàn)藍(lán)色3.（2018?北京）用XhoⅠ和SalⅠ兩種限制性核酸內(nèi)切酶分別處理同一DNA片段，酶切位點(diǎn)及酶切產(chǎn)物分離結(jié)果如圖。以下敘述不正確的是（）A．圖1中兩種酶識(shí)別的核苷酸序列不同 B．圖2中酶切產(chǎn)物可用于構(gòu)建重組DNA C．泳道①中是用SalⅠ處理得到的酶切產(chǎn)物 D．圖中被酶切的DNA片段是單鏈DNA4.（2017?北京）為了增加菊花花色類型，研究者從其他植物中克隆出花色基因C（圖1），擬將其與質(zhì)粒（圖2）重組，再借助農(nóng)桿菌導(dǎo)入菊花中。下列操作與實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟环氖牵ǎ〢．用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRⅠ和連接酶構(gòu)建重組質(zhì)粒 B．用含C基因的農(nóng)桿菌侵染菊花愈傷組織，將C基因?qū)爰?xì)胞 C．在培養(yǎng)基中添加卡那霉素，篩選被轉(zhuǎn)化的菊花細(xì)胞 D．用分子雜交方法檢測(cè)C基因是否整合到菊花染色體上5．（2023·全國(guó)乙卷高考真題）用DNA重組技術(shù)可以賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人類需要的生物產(chǎn)品。在此過(guò)程中需要使用多種工具酶，其中4種限制性核酸內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)如圖所示?；卮鹣铝袉?wèn)題：（1）常用的DNA連接酶有E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶。上圖中__________酶切割后的DNA片段可以用E.coliDNA連接酶連接。上圖中___________酶切割后的DNA片段可以用T4DNA連接酶連接。（2）DNA連接酶催化目的基因片段與質(zhì)粒載體片段之間形成的化學(xué)鍵是____________。（3）DNA重組技術(shù)中所用的質(zhì)粒載體具有一些特征，如質(zhì)粒DNA分子上有復(fù)制原點(diǎn)，可以保證質(zhì)粒在受體細(xì)胞中能___________；質(zhì)粒DNA分子上有______________，便于外源DNA插入；質(zhì)粒DNA分子上有標(biāo)記基因（如某種抗生素抗性基因），利用抗生素可篩選出含質(zhì)粒載體的宿主細(xì)胞，方法是______________。（4）表達(dá)載體含有啟動(dòng)子，啟動(dòng)子是指__________________。6.（2021海南）25．CRISPR/Cas9是一種高效的基因編輯技術(shù)，Cas9基因表達(dá)的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在單鏈向?qū)NA（SgRNA）引導(dǎo)下，切割DNA雙鏈以敲除目標(biāo)基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的工作原理如圖所示?；卮鹣铝袉?wèn)題。（1）過(guò)程①中，為構(gòu)建CRISPR/Cas9重組質(zhì)粒，需對(duì)含有特定sgRNA編碼序列的DNA進(jìn)行酶切處理，然后將其插入到經(jīng)相同酶切處理過(guò)的質(zhì)粒上，插入時(shí)所需要的酶是____________。（2）過(guò)程②中，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞的方法是____________。（3）過(guò)程③~⑤中，SgRNA與Cas9蛋白形成復(fù)合體，該復(fù)合體中的SgRNA可識(shí)別并與目標(biāo)DNA序列特異性結(jié)合，二者結(jié)合所遵循的原則是____________。隨后，Cas9蛋白可切割____________序列。（4）利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除一個(gè)長(zhǎng)度為1200bp的基因，在DNA水平上判斷基因敲除是否成功所采用的方法是____________，基因敲除成功的判斷依據(jù)是____________。（5）某種蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白?？蒲腥藛T將該蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9質(zhì)粒中獲得重組質(zhì)粒，隨后將其導(dǎo)入到大腸桿菌細(xì)胞，通過(guò)基因編輯把該蛋白酶基因插入到基因組DNA中，構(gòu)建得到能大量分泌該蛋白酶的工程菌。據(jù)圖簡(jiǎn)述CRISPR/Cas9重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞內(nèi)，將該蛋白酶基因插入到基因組DNA的編輯過(guò)程：________________________。7.（2021遼寧，24）PHB2蛋白具有抑制細(xì)胞增殖的作用。為初步探究某動(dòng)物PHB2蛋白抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖的原因，研究者從基因數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取了該蛋白的基因編碼序列（簡(jiǎn)稱phb2基因），大小為0．9kb（1kb=1000堿基對(duì)），利用大腸桿菌表達(dá)該蛋白?；卮鹣铝袉?wèn)題：（1）為獲取phb2基因，提取該動(dòng)物肝臟組織的總RNA，再經(jīng)__________過(guò)程得到cDNA，將其作為PCR反應(yīng)的模板，并設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物來(lái)擴(kuò)增目的基因。（2）圖1為所用載體圖譜示意圖，圖中限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)見(jiàn)下表。為使phb2基因（該基因序列不含圖1中限制酶的識(shí)別序列）與載體正確連接，在擴(kuò)增的phb2基因兩端分別引入__________和__________兩種不同限制酶的識(shí)別序列。經(jīng)過(guò)這兩種酶酶切的phb2基因和載體進(jìn)行連接時(shí)，可選用__________（填“E．coliDNA連接酶”或“T4DNA連接酶”）。相關(guān)限制酶的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)名稱識(shí)別序列及切割位點(diǎn)名稱識(shí)別序列及切割位點(diǎn)HindⅢA↓AGCTTTTCGA↑AEcoRIG↓AATTCCTTAA↑GPvitⅡCAG↓CTGGTC↑GACPstICTGC↓AGGA↑CGTCKpnIG↓GTACCCCATG↑GBamHIG↓GATCCCCTAG↑G注：箭頭表示切割位點(diǎn)（3）轉(zhuǎn)化前需用CaCl2處理大腸桿菌細(xì)胞，使其處于__________的生理狀態(tài)，以提高轉(zhuǎn)化效率。（4）將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌接種在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，隨機(jī)挑取菌落（分別編號(hào)為1、2、3、4）培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，用（2）中選用的兩種限制酶進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)電分離，結(jié)果如圖2，________號(hào)菌落的質(zhì)粒很可能是含目的基因的重組質(zhì)粒。注：M為指示分子大小的標(biāo)準(zhǔn)參照物；小于0．2kb的DNA分子條帶未出現(xiàn)在圖中（5）將純化得到的PHB2蛋白以一定濃度添加到人宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24小時(shí)后，檢測(cè)處于細(xì)胞周期（示意圖見(jiàn)圖3）不同時(shí)期的細(xì)胞數(shù)量，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖4。分析該蛋白抑制人宮頸癌細(xì)胞增殖可能的原因是將細(xì)胞阻滯在細(xì)胞周期的__________（填“G1”或“S”或“G2/M”）期。【過(guò)關(guān)檢測(cè)】1.在基因工程操作中限制酶是不可缺少的工具。下列關(guān)于限制酶的敘述錯(cuò)誤的是()A.限制酶主要是從原核細(xì)胞中獲取的B.每一種限制酶只能識(shí)別特定的核苷酸序列C.限制酶的作用位點(diǎn)是相鄰核苷酸之間的氫鍵D.同一種限制酶切割不同的DNA分子可產(chǎn)生堿基互補(bǔ)配對(duì)的黏性末端2.下表為4種限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)(↓表示切割位點(diǎn)),下列敘述正確的是()限制酶1—↓GATC—限制酶2—CATG↓—限制酶3—G↓GATCC—限制酶4—GG↓CGCC—A.在使用限制酶的同時(shí)還需要解旋酶B.限制酶1和3切割DNA分子產(chǎn)生的黏性末端相同C.圖中限制酶的識(shí)別序列都由4個(gè)核苷酸組成D.限制酶4作用后產(chǎn)生的是平末端3.以下是幾種不同限制性核酸內(nèi)切酶切割DNA分子后形成的部分片段。下列的敘述中,正確的是（

）A．以上DNA片段是由4種限制酶切割后產(chǎn)生的B．②片段是在酶切位點(diǎn)為的限制酶作用下形成的C．①和④兩個(gè)片段在DNA聚合酶的作用下形成的重組DNA分子D．限制酶和DNA連接酶作用的部位都是磷酸二酯鍵4.DNA連接酶是基因工程的必需工具,下列有關(guān)DNA連接酶的敘述,正確的是 ()A.DNA連接酶可以將任意的兩個(gè)DNA片段連接成一個(gè)重組DNA分子B.DNA連接酶發(fā)揮作用時(shí)需要識(shí)別特定的脫氧核苷酸序列C.DNA連接酶可以催化兩個(gè)脫氧核苷酸之間磷酸二酯鍵的形成D.E.coliDNA連接酶和T4DNA連接酶都能連接黏性末端和平末端5.作為基因工程的運(yùn)輸工具——載體,必須具備的條件及理由對(duì)應(yīng)錯(cuò)誤的是 ()A.能夠在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定保存并大量復(fù)制,以便提供大量的目的基因B.具有一個(gè)至多個(gè)限制酶切割位點(diǎn),以便于目的基因的插入C.具有某些標(biāo)記基因,以便目的基因能夠準(zhǔn)確定位與其結(jié)合D.對(duì)宿主細(xì)胞無(wú)傷害,以免影響宿主細(xì)胞的正常生命活動(dòng)6.[2023寧夏石嘴山高三月考]在重組DNA技術(shù)中,將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞,通常利用質(zhì)粒作為載體。下列關(guān)于質(zhì)粒的敘述,正確的是 ()A.質(zhì)粒是一種只存在于原核細(xì)胞中的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的環(huán)狀DNA分子B.質(zhì)粒的復(fù)制和表達(dá)過(guò)程遵循中心法則和堿基互補(bǔ)配對(duì)原則C.外源基因只有通過(guò)質(zhì)粒整合到受體細(xì)胞的DNA中才能表達(dá)D.大多數(shù)天然質(zhì)粒都不需要人工改造,可以直接作為載體使用7.下列關(guān)于“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的敘述,錯(cuò)誤的是 ()A.該實(shí)驗(yàn)不能選擇哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料B.將洋蔥研磨液置于4℃冰箱中能防止DNA被降解C.該實(shí)驗(yàn)中加入體積分?jǐn)?shù)為70%的預(yù)冷酒精可用來(lái)析出、純化DNAD.用二苯胺試劑鑒定DNA需要進(jìn)行沸水浴加熱8.如圖為“DNA的粗提取與鑒定”實(shí)驗(yàn)的部分操作流程。下列相關(guān)敘述正確的是()A.將圖1中的研磨液過(guò)濾后保留沉淀B.圖2過(guò)程,用玻璃棒進(jìn)行快速交叉攪拌會(huì)使DNA析出更快C.圖2析出得到的白色絲狀物只能溶于2mol/L的NaCl溶液D.圖3對(duì)提取后的DNA進(jìn)行鑒定,兩支試管中均要加入二苯胺試劑8.下列有關(guān)基因工程工具的敘述,錯(cuò)誤的是 ()A.