圖像分析基本原理及分析過(guò)程

圖像分析基本原理及分析過(guò)程

概述

在生物及醫(yī)學(xué)研究中，對(duì)圖像的判讀與分析特別是對(duì)顯微鏡下微觀圖像的觀察研究從來(lái)都是重要的研究手段。隨著技術(shù)的進(jìn)步，分析圖像的方法也從眼觀尺量進(jìn)入到了使用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行定量分析的階段。計(jì)算機(jī)軟件的發(fā)展速度呈加速前進(jìn)，采集圖像的設(shè)備也不斷更新，這使得我們能有更多的手段來(lái)分析測(cè)量復(fù)雜的生物圖像。

現(xiàn)在我們可以使用CCD數(shù)碼相機(jī)來(lái)采集圖像。使用功能比較強(qiáng)大的圖像分析軟件來(lái)進(jìn)行圖像分析測(cè)量。相比之下，在不太久遠(yuǎn)的十來(lái)年前使用的圖像分析儀及單色的圖像采集攝像機(jī)已經(jīng)過(guò)時(shí)了。而圖像分析的手段也比以前豐富。簡(jiǎn)單地引用以前的分析方法未必就是最佳的方法，在許多情況下，需要我們依據(jù)軟件及相機(jī)的情況設(shè)計(jì)與研究目標(biāo)相適應(yīng)的分析方法。

分析測(cè)量圖像絕不僅僅是一個(gè)軟件使用的問(wèn)題，而是從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)開(kāi)始，就要綜合考慮研究目標(biāo)、樣品制作方法、拍攝方式、選擇視野等各方面因素，最后才是通過(guò)軟件實(shí)現(xiàn)最有效的圖像分析測(cè)量。一個(gè)完整的圖像分析過(guò)程應(yīng)該包括：

1.明確需要測(cè)量分析的對(duì)象。

2.使用適當(dāng)?shù)姆椒ㄅ臄z下這個(gè)對(duì)象，包括進(jìn)行適當(dāng)?shù)娜旧叭樱杉酵怀鲲@示的測(cè)量對(duì)象的照片。

3.分析照片上的圖像元素,確定能反映測(cè)量對(duì)象的圖像圖形

4.測(cè)量照片上的圖形的測(cè)量參數(shù),進(jìn)而得到測(cè)量對(duì)象的測(cè)量數(shù)據(jù)

5.對(duì)測(cè)量對(duì)象進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。圖像分析的最佳效果，是利用圖像分析軟件可以自動(dòng)地判斷測(cè)量目標(biāo)，準(zhǔn)確分析測(cè)量出目標(biāo)對(duì)象的數(shù)值。由于生物圖像的復(fù)雜性，軟件往往作不到這一點(diǎn)。此時(shí)只能退而求其次，采取抽樣統(tǒng)計(jì)，手工選擇等方法進(jìn)行近似的測(cè)量。測(cè)量方法本身有時(shí)候也能成為一個(gè)研究課題。一、把研究目標(biāo)轉(zhuǎn)換到圖像分析問(wèn)題上。

在丁香園混了好幾年了，雖然很喜歡與大家討論圖像分析的問(wèn)題，但是卻經(jīng)常對(duì)一些求助視而不見(jiàn)，例如：

請(qǐng)問(wèn)用IPP怎么分析雙染的結(jié)果？謝謝！

最近正要測(cè)腎小球面積以及球內(nèi)PAS染色陽(yáng)性面積（粉紫色），不會(huì)操作，希望各位老師及同仁多多指教，非常感謝！傳張片子上來(lái)，請(qǐng)指導(dǎo)一下哦！

免疫熒光定量分析選什么軟件好？是IPP嗎？

這個(gè)軟件可以做雜交結(jié)果的分析嗎？具體如下：雜交后獲得陽(yáng)性結(jié)果和陰性對(duì)照的結(jié)果，如何分析結(jié)果呢？下面是陽(yáng)性和陰性的圖。謝謝您的解答。

我做的是臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞管道形成實(shí)驗(yàn)，需要計(jì)算整張圖片上內(nèi)皮細(xì)胞管道的數(shù)目以及管道的總長(zhǎng)度，這個(gè)怎么用IPP計(jì)算??？希望能夠提供詳細(xì)步驟（附有圖片）。謝謝?。。?/p>

我們?cè)趯?duì)免疫組化照片的陽(yáng)性區(qū)域，進(jìn)行最后的的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析時(shí)，用的應(yīng)該是哪個(gè)參數(shù)呢？

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上面這些提問(wèn)我是沒(méi)法回答的，除非是正好作過(guò)相關(guān)的研究，知道其來(lái)龍去脈。否則即使有圖片提交，也看不出哪里是腎小球內(nèi)PAS，哪里是管道。不知道需要分析的對(duì)象在哪里，當(dāng)然也就不會(huì)作了。

所以一個(gè)完整的圖像分析過(guò)程應(yīng)當(dāng)是前面所述的五條，其中最重要的卻不在圖像分析上，而在于確定所要分析的目標(biāo)以及如何把這個(gè)研究目的轉(zhuǎn)換成圖像分析的問(wèn)題。這是圖像分析的關(guān)鍵之處。

當(dāng)然，如果是常用的分析測(cè)量，是已經(jīng)有比較成熟的方法的，以免疫組化樣品為例：

免疫組化的分析對(duì)象（分析測(cè)量的目標(biāo)）是組織切片上特定蛋白的表達(dá)量。為了達(dá)到這個(gè)測(cè)量目標(biāo)，先用特定抗體與切片反應(yīng)，使之與切片上的特定蛋白結(jié)合，然后用DAB對(duì)結(jié)合了蛋白的抗體進(jìn)行染色。這樣，DAB的染色深淺及范圍就能反應(yīng)切片上相應(yīng)蛋白的表達(dá)量了。所以免疫組化技術(shù)就是把切片上“蛋白表達(dá)量”這個(gè)研究目標(biāo)轉(zhuǎn)換成了切片上“黃色染色物的分布”這個(gè)圖像分析問(wèn)題。

熒光標(biāo)記的免疫組化圖片與此類似。

另一個(gè)例子：

利用凝膠電泳方法來(lái)測(cè)量RT-PCR產(chǎn)物的分子量及質(zhì)量（重量），研究目標(biāo)是樣品中各種DNA片段的分子量與質(zhì)量。通過(guò)電泳把加樣孔中的樣品分布到泳道之中后，不同分子量的產(chǎn)物成份會(huì)分布到泳道的不同位置，形成條帶。用EB染色后，在紫外燈照射下各條帶發(fā)出熒光，就能顯示出條帶的位置與強(qiáng)度信息。這樣就把研究目標(biāo)（產(chǎn)物的各組分分子量與該組分的量重）轉(zhuǎn)換成了凝膠圖像上的條帶的位置與光密度這個(gè)圖像分析問(wèn)題。

具體到前面提到的那些沒(méi)法回答的問(wèn)題，實(shí)際上就是提問(wèn)的信息不夠，沒(méi)法確定如何把研究目標(biāo)轉(zhuǎn)換為圖像分析問(wèn)題。當(dāng)然，這類分析方法往往是從文獻(xiàn)上查找到的，是已經(jīng)有的分析方法，這時(shí)候就要仔細(xì)學(xué)習(xí)參考文獻(xiàn)上相關(guān)的敘述，弄明白文獻(xiàn)上的方法是把分析目標(biāo)轉(zhuǎn)換成什么樣的圖像分析目標(biāo)。明確了這一點(diǎn)后，才能考慮如何通過(guò)圖像分析軟件實(shí)現(xiàn)正確的測(cè)量。甚至進(jìn)一步改進(jìn)測(cè)量方法。二、正確地處理樣品并進(jìn)行拍攝。

處理樣品主要是指對(duì)切片作正確的染色。雖然染色的方法基本上有一個(gè)規(guī)范的程序，但進(jìn)行圖像分析的時(shí)候，根據(jù)分析目標(biāo)對(duì)染色方法作適當(dāng)?shù)膬?yōu)化能讓分析測(cè)量更加方便準(zhǔn)確。

在免疫組化切片染色時(shí)，由于要分析比較染色深淺，所以在制片時(shí)就要強(qiáng)調(diào)以同樣條件制作所有的組織切片。曾經(jīng)遇到一位，在染色時(shí)，遇到陰性樣品就有意延長(zhǎng)一下顯色時(shí)間，讓片子黃一點(diǎn)，結(jié)果是陰性結(jié)果的光密度測(cè)量數(shù)值與陽(yáng)性樣品一樣大。

如果要分析細(xì)胞核，就得特別注意蘇木青藍(lán)染的深淺要適當(dāng)，一般情況下，淺淺的藍(lán)色只能標(biāo)記出細(xì)胞核的位置，明顯的藍(lán)色才適合于進(jìn)行細(xì)胞核尺寸的測(cè)量或?qū)?xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。而在進(jìn)行細(xì)胞核上蛋白的免疫組化分析時(shí)，過(guò)淺的藍(lán)染會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞核選擇困難，過(guò)深的藍(lán)染則會(huì)掩蓋免疫組化產(chǎn)物的顏色。

關(guān)于熒光免疫組化的染色就更復(fù)雜了，單染色的樣品要注意樣品熒光與背景熒光的對(duì)比度要足夠高。雙染色的樣品還要注意兩種染料的熒光強(qiáng)度應(yīng)當(dāng)適配，不要一種顏色的熒光特別強(qiáng)，另一種特別弱。最常見(jiàn)的是紅色熒光特別亮，而FITC的綠色卻很弱。結(jié)果是在拍攝時(shí)綠色的熒光實(shí)際上是紅色熒光圖像的綠色分量。

拍攝樣品時(shí)影響的因素更多，更容易出錯(cuò)。

在拍攝大體物品時(shí)要特別注意背景與物體之間的對(duì)比。在拍攝離體組織器官時(shí)，把組織塊放在干凈的白紙或黑紙上以保證組織圖像與背景之間有清晰的分界線，在兩側(cè)各用燈光照明以避免留下影子。在缺乏照明條件的時(shí)候，也可以選擇在室外背光處拍攝，既有足夠的照明也能避免明顯的陰影。

一般的組織切片只要正確選擇視野并拍攝清楚就行了。而免疫組化的樣品卻額外要注意拍攝時(shí)的曝光：以同樣的曝光條件拍攝樣品。特別是熒光，一個(gè)對(duì)照組的弱熒光樣品，就應(yīng)該拍攝得光強(qiáng)較弱，陰性的甚至拍攝出一張黑照片。如果有意延長(zhǎng)弱樣品的曝光，照片雖然漂亮，但其表現(xiàn)的光密度就與陽(yáng)性樣的強(qiáng)熒光差不多了。所以在我介紹免疫組化樣品的分析方法之前，都是先強(qiáng)調(diào)如何拍攝樣品。

在使用倒置顯微鏡拍攝活細(xì)胞的時(shí)候，很多人并未注意到在顯微鏡上方的燈光筒下邊有一個(gè)長(zhǎng)方形可推移的板，上面有三四個(gè)大小不一的園孔，這幾個(gè)孔的位置是與物鏡的選擇有關(guān)的。高倍鏡要使用小孔，低倍鏡用大點(diǎn)的孔。選擇不對(duì)的時(shí)候，觀察圖像的反差不好。

拍攝彩色照片的時(shí)候，相機(jī)色彩也是常被忽視的。最常見(jiàn)的是拍攝的照片色彩偏藍(lán)。這對(duì)分析免疫組化圖片的影響非常大。偏藍(lán)的照片不僅降低了黃色深色的深淺程度，而且會(huì)使較淺的黃色變成了白色甚至淺藍(lán)色。三、確定圖片上的測(cè)量目標(biāo)

在分析圖片時(shí)，雖然我們嘴上說(shuō)的是測(cè)量細(xì)胞、細(xì)胞核或胞漿。但是心里應(yīng)該有一個(gè)概念，就是實(shí)際上我們測(cè)量的是圖片上的一片黃色，一個(gè)藍(lán)色的園斑，或者一些邊界線圍成的區(qū)域，或者是某種色彩組成的區(qū)域。有了這個(gè)概念，才能真正地把研究目標(biāo)轉(zhuǎn)換到圖像分析的目標(biāo)。進(jìn)而進(jìn)行正確的測(cè)量。

生物圖像幾乎沒(méi)有直線、正方或圓形這樣規(guī)則的圖形。因此，要測(cè)量對(duì)象的長(zhǎng)度，面積，直徑這些指標(biāo)時(shí)，是需要考慮該如何進(jìn)行近似測(cè)量或等效測(cè)量的。軟件可以準(zhǔn)確測(cè)量不規(guī)則曲線的長(zhǎng)度與不規(guī)則區(qū)域的面積。其他的指標(biāo)往往就需要作等效計(jì)算或近似計(jì)算。

例如：測(cè)量細(xì)胞的半徑?？梢韵葴y(cè)量細(xì)胞的面積，然后利用area=pi*r^2公式計(jì)算其等效半徑。也可以通過(guò)細(xì)胞中心畫(huà)一組放射線，測(cè)量細(xì)胞在這些放射線方向上的直徑，然后取平均值作為它的近似測(cè)量值。這種測(cè)量等效值或近似值的照片的染色很淺。但某些細(xì)小的點(diǎn)上的密度卻不小。如果只計(jì)算這些染色的小片區(qū)域，最后計(jì)算出來(lái)的平均光密度值將是一個(gè)不小的錯(cuò)誤數(shù)值。直接比較整張圖片的積分光密度值。實(shí)際上測(cè)量面積就是整張圖片的面積。

比較特定區(qū)域的平均光密度值。在一張圖片上有許多區(qū)域的時(shí)候，可以只抽取其中部分試樣來(lái)測(cè)量的。這影響到的是抽樣量。當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)盡可能地測(cè)量圖片上全部應(yīng)當(dāng)測(cè)量的區(qū)域。

同一張圖片上不同的區(qū)域之間進(jìn)行比較。這時(shí)候一張圖片上能得到一對(duì)數(shù)據(jù)，全部樣品測(cè)量數(shù)據(jù)可以作配對(duì)T-檢驗(yàn)。

測(cè)量圖片上一個(gè)特定區(qū)域內(nèi)的平均光密度。注意選擇測(cè)量區(qū)域的時(shí)候，選得不太準(zhǔn)不要緊，這仍然是個(gè)抽樣的問(wèn)題，它對(duì)平均光密度值的影響是很小的。

測(cè)量區(qū)域就是染上了顏色的細(xì)胞，此時(shí)在測(cè)量黃色的IOD值的時(shí)候能同時(shí)測(cè)量出面積來(lái)。不必另外去選擇測(cè)量區(qū)域。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可以有多種測(cè)量指標(biāo)供選擇：每個(gè)細(xì)胞的面積，積分光密度，平均光密度，照片上的細(xì)胞數(shù)量（其實(shí)就是細(xì)胞密度）等等。

測(cè)量了圖片上特定區(qū)域的IOD之后，還需要測(cè)量這個(gè)區(qū)域的面積。然后計(jì)算出一個(gè)平均光密度值（meanopticaldensity=IODSUM/areaSUM）在整個(gè)分析過(guò)程中，一般每張圖片測(cè)量出的只是一個(gè)平均光密度值，作為一個(gè)測(cè)量數(shù)據(jù)。一張切片則需要拍攝多張照片，這些照片各自的光密度平均值平均之后可以作為這張切片的測(cè)量數(shù)值。一個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品又可能會(huì)制作多張切片，所以最終一個(gè)樣品（一塊組織，一個(gè)動(dòng)物，一個(gè)病例等）的測(cè)量數(shù)據(jù)就是所有這些照片的平均光密度值的平均值。在兩組實(shí)驗(yàn)樣品的統(tǒng)計(jì)處理中，就是把每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品的所有照片的平均光密度值再作一次平均，作為該樣品的測(cè)量數(shù)值。一組樣品的測(cè)量值再計(jì)算其平均值與標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)細(xì)胞核上蛋白的免疫組化測(cè)量有其特殊性。如果蛋白只在細(xì)胞核上表達(dá)，則不需要對(duì)核作藍(lán)染，切片上只有細(xì)胞核上有黃色染色物?？梢灾苯舆M(jìn)行分析測(cè)量。

在更多的情況下，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行藍(lán)染是必須的。只有染上藍(lán)色才能判斷細(xì)胞核的區(qū)域。但同時(shí)，藍(lán)染對(duì)細(xì)胞核的光密度測(cè)量造成了嚴(yán)重干擾。會(huì)導(dǎo)致光密度測(cè)量值的極大誤差。這時(shí)候用肉眼主觀判斷與圖像分析測(cè)量的結(jié)果基本上沒(méi)啥區(qū)別了。一個(gè)主觀的定量方法就是用肉眼判斷陽(yáng)性細(xì)胞核與陰性細(xì)胞核，然后計(jì)數(shù)