松樹取樣與松材線蟲分離操作指南

3松材線蟲取樣與分離操作指南本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了松材線蟲取樣與分離操作的術(shù)語和定義、基本要求、技術(shù)要求、檔案管理、安全要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于松材線蟲取樣和分離。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本標(biāo)準(zhǔn)中必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)：不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。GB/T23478-2009松材線蟲普查監(jiān)測技術(shù)規(guī)程3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)3.1松材線蟲Bursaphelenchusxylophilus(Steiner＆Buhrer)Nickle一種無脊椎動物，屬于線蟲門，側(cè)尾腺口綱，滑刃目，滑刃總科，滑刃科，傘滑刃亞科，傘滑刃屬。[來源：GB/T23478-2009,3.1]3.2松材線蟲病pinewiltdiseasecausedbypinewoodnematode由松材線蟲寄生在松樹體內(nèi)引起松樹迅速死亡的一種毀滅性林木病害。又稱松樹萎蔫病、松材線蟲萎蔫病、松樹枯萎病。[來源：GB/T23478-2009,3.2]3.3松樹取樣sampleseparationofthepinetree用高枝剪、電鉆、油鋸等工具對不同感病時期的松樹進行取樣，樣本類型包括枝條、圓盤、木屑等。3.4媒介昆蟲vectorinsect將松材線蟲由罹病樹中攜帶出，通過補充營養(yǎng)或產(chǎn)卵時造成的創(chuàng)口又將其傳染到其他寄主松樹上的昆蟲，是松材線蟲病發(fā)生不可缺少的條件，也是松材線蟲病侵染循環(huán)的組成部分之一。目前，在我國松材線蟲病的媒介昆蟲主要為松褐天牛MonochamusalternatusHope。[來源：GB/T23478-2009,3.6，有修改]3.5負(fù)壓分離法negativepressureseparationmethod利用壓差與水流相配合的工作原理，通過負(fù)壓分離器，使檢材微管中的松材線蟲隨通過的水流被帶出，得到待檢溶液。3.6信息管理系統(tǒng)informationmanagementsystem一個方便作業(yè)人員管理，由計算機和相關(guān)技術(shù)支持的組織內(nèi)部和外部業(yè)務(wù)活動的信息采集、處理、存儲和傳遞的系統(tǒng)，應(yīng)用大數(shù)據(jù)、智能分析及可視化等先進技術(shù)手段，對現(xiàn)場作業(yè)信息進行歸檔記錄，對現(xiàn)場操作情況進行檢查與規(guī)范。44基本要求4.1山場取樣的作業(yè)環(huán)境天氣情況：應(yīng)避免雨雪、雷電、大風(fēng)、大霧天氣。4.2取樣的樣本類型樣本類型為枝條、木條、圓盤、木屑、木片等。4.3取樣工具高枝剪、手工鉆、油鋸、柴刀、記號筆、塑料袋、安全帽、手套等。4.4山場取樣的作業(yè)時間病害發(fā)生1-2月內(nèi)及時取樣，優(yōu)先考慮秋冬兩季進行取樣。4.5山場作業(yè)安全要求①提高作業(yè)人員安全意識，確保作業(yè)人員了解并掌握必要的安全知識與技能。②作業(yè)前向相關(guān)部門申請許可，嚴(yán)格按照許可內(nèi)容進行作業(yè)。③為作業(yè)人員配備必要的安全防護裝備，如安全帽、防護服、防護鞋等。同時定期對裝備進行檢查與維護。對于高空、陡峭等危險作業(yè)環(huán)境，應(yīng)設(shè)置安全網(wǎng)、防護欄等設(shè)施，防止作業(yè)人員跌落等意外事故發(fā)生。④加強現(xiàn)場監(jiān)管力度，安排專人對作業(yè)現(xiàn)場進行巡查，及時發(fā)現(xiàn)并排除安全隱患。⑤根據(jù)山林作業(yè)的特點和可能發(fā)生的意外事故類型，指定相應(yīng)的應(yīng)急措施和救援方案。⑥山林作業(yè)嚴(yán)禁煙火，必須采取嚴(yán)格的禁火措施，在作業(yè)現(xiàn)場設(shè)置明顯的禁火標(biāo)志，嚴(yán)禁攜帶易燃易爆物品進入作業(yè)區(qū)域。⑦山林作業(yè)應(yīng)注意環(huán)境保護，采取有效的環(huán)保措施。作業(yè)過程中，應(yīng)減少對周圍環(huán)境的破壞和污染，作業(yè)完成后，應(yīng)及時清理現(xiàn)場，恢復(fù)環(huán)境原貌。5取樣標(biāo)準(zhǔn)5.1山場取樣5.1.1松樹病害分級取樣之前對感病松樹進行病害分級。根據(jù)針葉褪綠、枯黃和變紅的程度分為五級：0級為正常，Ⅰ級為褪綠、部分針葉（1/4以下）變黃，Ⅱ級為2/4～3/4針葉變黃、1/4以下針葉變紅，Ⅲ級為3/4左右針葉變紅，Ⅳ級為全變紅、死亡[1]。5.1.2松樹樣樹選擇在一片小班或林分中，選取長勢旺盛的林間感病優(yōu)勢木或生長勢正常的感病林緣木、孤立木，且樹干上通常無松脂溢出或較少的松脂溢出，枝條上有松褐天牛成蟲補充營養(yǎng)痕跡的作為采樣對象，尤其是出現(xiàn)在向陽山坡、林緣的病樹，不宜選擇生長勢衰弱的松樹或被壓木。5.1.3松樹取樣部位Ⅰ~Ⅱ級感病松樹：用高枝剪剪取高處感病樹枝，盡量多采取側(cè)枝。Ⅲ級感病松樹：用柴刀砍去樹皮后，再用手工鉆或其他工具對主干胸高部位不同方向選取3-5個點鉆取木屑共50g或砍取木片100-200g，如果砍去樹皮后，發(fā)現(xiàn)藍變、天牛成蟲產(chǎn)卵痕跡和幼蟲蛀道等特征時，優(yōu)先對該區(qū)域進行取5樣。Ⅳ級感病松樹：用油鋸砍倒松樹，鋸得多個主干部位圓盤，厚度約5-10cm，優(yōu)先鋸取有藍變、天牛成蟲產(chǎn)卵痕跡和幼蟲蛀道等特征的圓盤。5.1.4松樹取樣數(shù)量以小班為單位取樣，死亡松樹數(shù)量小于100株的，先取樣10株進行檢測，如檢測到松材線蟲，可不再取樣；如沒有檢測到松材線蟲，則繼續(xù)取樣檢測，直至死亡松樹全部取樣檢測為止；死亡松樹大于100株的，如取樣100株仍未檢測到松材線蟲，對超出部分按5%的比例進行抽樣檢測。5.2鋸材取樣①圓木樁類：⑴用手工鉆或其他工具對截斷面木質(zhì)部區(qū)域選取3-5點鉆取木屑共50g，如發(fā)現(xiàn)藍變、產(chǎn)卵孔痕跡和蛀道等典型特征則優(yōu)先鉆取該區(qū)域木屑，同時應(yīng)避免在髓心部位取樣。⑵用油鋸鋸成多個5-10cm厚的圓盤。②膠合板、木質(zhì)電纜盤等形狀規(guī)則的木制半成品類：⑴用手工鉆或其他工具對截斷面區(qū)域選取3-5點鉆取木屑共50g，如發(fā)現(xiàn)藍變、產(chǎn)卵孔痕跡和蛀道等典型特征則優(yōu)先鉆取該區(qū)域木屑。⑵用柴刀劈成多個長3cm直徑5mm左右的木條約150g。5.3木制品取樣如已做成工藝品、家具、裝飾品等形狀不規(guī)則的木制成品可考慮：⑴用手工鉆或其他工具對不同部位鉆取木屑共50g。⑵用柴刀劈成長3cm直徑5mm左右的木條約150g。5.4鋸材與木制品取樣數(shù)量須先全面檢查其外表，對發(fā)現(xiàn)可疑癥狀的鋸材與木制品全部取樣，如未發(fā)現(xiàn)可疑癥狀則按照每批總數(shù)比例的0.5%～5.0%隨機取樣。5.5樣本管理將所取樣本裝入塑料袋中，并用記號筆做好標(biāo)記，放入4℃條件下保濕保存。6檔案管理將樣本信息輸入信息管理系統(tǒng)中，其中至少要包括以下信息：①取樣地點②取樣樹種③取樣時間④固定標(biāo)牌編號7松材線蟲的分離7.1不同類型樣本的分離方法選擇①枝條/木條：貝爾曼漏斗法②木屑：貝爾曼漏斗法③圓盤：負(fù)壓分離法7.2分離流程7.2.1貝爾曼漏斗法①取滅菌后的玻璃漏斗，并在其下面接上乳膠管，在乳膠管上夾一個止水夾，再向漏斗中加入清6水（檢查并確保不漏水），將漏斗置于架上。②取上述劈好的樣木組織約50~100g，用300目紗布包好，輕放在漏斗中，再放入清水，清水以浸沒分離材料為宜。③室溫20℃放置24h后，打開止水夾，慢放出底部約5mL水樣于15mL的滅菌離心管中。用吸管吸一2-3min）沉降后再檢查。7.2.2負(fù)壓分離法7.2.2.1檢材的預(yù)處理①取得無松脂殘留且斷面平整的圓盤，直徑5.0～20.0cm，厚度10cm左右為宜。②將AB膠各擠出15克，按照1:1比例混勻，并將吸附罩與待檢木材膠合。③待膠水干后，將檢材浸泡于水中5～10分鐘。7.2.2.2線蟲的分離①取一桶清水，將預(yù)處理好的檢材浸泡在清水中（水面略低于檢材的上沿）。②打開電源開關(guān)，負(fù)壓分離器開始工作，適當(dāng)調(diào)節(jié)負(fù)壓吸力的大小，可見負(fù)壓表的指針逆時針旋轉(zhuǎn)，此時吸附罩內(nèi)有水滲入，等水逐漸增多達到待檢量時，關(guān)閉電源開關(guān)。③將吸附罩上的膠管拔下，將吸附罩內(nèi)的溶液倒入試管或燒杯中，待檢。④待檢溶液靜置十分鐘左右，吸取底部帶有沉淀的分離液少許，進行檢