《RNAi綜述完整》課件

RNAi綜述中科院植物研究所陳寧1精選課件ppt

摘要

雙鏈RNA介導(dǎo)的遺傳干擾的機(jī)制是1998年發(fā)現(xiàn)的。它通過雙鏈RNA的介導(dǎo)特異性的降解相應(yīng)序列的mRNA，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。2精選課件ppt到目前為止在真菌、擬南芥、線蟲、錐蟲、果蠅、小鼠、斑馬魚等真核生物中都發(fā)現(xiàn)存在這一基因沉默機(jī)制。目前的研究表明，RNA干擾與植物中的共抑制、真菌中的基因壓制很可能具有共同的基本分子機(jī)制。RNA干擾對(duì)于抵抗病毒入侵、抑制轉(zhuǎn)座子活動(dòng)等具有重要作用，對(duì)于生物體的發(fā)育和基因調(diào)控可能也有重要作用。3精選課件ppt1.RNA干擾的發(fā)現(xiàn)

1995年，康乃爾大學(xué)的SuGuo博士在試圖阻斷秀麗新小桿線蟲(C.elegans)的par-1基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)意想不到的現(xiàn)象。她們本想利用反義RNA技術(shù)特異性地阻斷上述基因的表達(dá)，而同時(shí)在對(duì)照實(shí)驗(yàn)中給線蟲注射正義RNA以期觀察到基因表達(dá)的增強(qiáng)，但得到的結(jié)果是二者都同樣地切斷了par-1基因的表達(dá)途徑。這是與傳統(tǒng)上對(duì)反義RNA技術(shù)的解釋正好相反。該研究小組一直未能給這個(gè)意外以合理解釋。4精選課件ppt1998年，華盛頓卡耐基研究院的Fire和麻省大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Mello首次在秀麗新小桿線蟲中證明上述現(xiàn)象屬于轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。他們發(fā)現(xiàn)SuGuo博士遇到的正義RNA抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象，以及過去的反義RNA技術(shù)對(duì)基因表達(dá)的阻斷，都是由于體外轉(zhuǎn)錄所得RNA中污染了微量雙鏈RNA而引起。當(dāng)他們將體外轉(zhuǎn)錄得到的單鏈RNA純化后注射線蟲時(shí)發(fā)現(xiàn)，基因抑制效應(yīng)變得十分微弱，而經(jīng)過純化的雙鏈RNA卻正好相反，能夠高效特異性阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)，其抑制基因表達(dá)的效率比純化后的反義RNA至少高2個(gè)數(shù)量級(jí)。該小組將這一現(xiàn)象稱為RNA干擾。5精選課件ppt安德魯·法爾（AndrewFire,1959—

），美國科學(xué)家、生物醫(yī)學(xué)家。1959年出生于美國，1983年獲美國麻省理工學(xué)院生物學(xué)博士學(xué)位。1998年，他和美國馬薩諸塞大學(xué)醫(yī)學(xué)院教授克雷格·梅洛在《自然》雜志上共同發(fā)表論文，稱他們發(fā)現(xiàn)了RNA具有可以干擾基因的機(jī)制。因在RNA（核糖核酸）干擾機(jī)制方面的突出貢獻(xiàn)，他倆一起獲得了2006年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。安德魯·法爾現(xiàn)任斯坦福醫(yī)學(xué)院病理學(xué)和遺傳學(xué)教授。

6精選課件ppt克雷格·梅洛（CraigC.Mello,1960年—），美國馬薩諸塞州大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)教授。2006年因與斯坦福醫(yī)學(xué)院病理學(xué)和遺傳學(xué)教授安德魯·法厄發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象而共同獲得2006年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

克雷格·梅洛出生于1960年，美國公民，1990年獲得哈佛大學(xué)的生物學(xué)博士學(xué)位，現(xiàn)任馬薩諸塞州醫(yī)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)教授。

7精選課件ppt2.RNA干擾的作用機(jī)制

當(dāng)病毒基因、人工轉(zhuǎn)入基因、轉(zhuǎn)座子等外源性基因隨機(jī)整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，并利用宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄時(shí)，常產(chǎn)生一些dsRNA。宿主細(xì)胞對(duì)這些dsRNA迅即產(chǎn)生反應(yīng)，其胞質(zhì)中的核酸內(nèi)切酶Dicer將dsRNA切割成多個(gè)具有特定長度和結(jié)構(gòu)的小片段RNA（大約21～23bp），即siRNA。siRNA在細(xì)胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，繼之由反義siRNA再與體內(nèi)一些酶(包括內(nèi)切酶、外切酶、解旋酶等)結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。8精選課件pptRISC與外源性基因表達(dá)的mRNA的同源區(qū)進(jìn)行特異性結(jié)合，RISC具有核酸酶的功能，在結(jié)合部位切割mRNA，切割位點(diǎn)即是與siRNA中反義鏈互補(bǔ)結(jié)合的兩端。被切割后的斷裂mRNA隨即降解，從而誘發(fā)宿主細(xì)胞針對(duì)這些mRNA的降解反應(yīng)。siRNA不僅能引導(dǎo)RISC切割同源單鏈mRNA，而且可作為引物與靶RNA結(jié)合并在RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRP)作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割產(chǎn)生大量的次級(jí)siRNA，從而使RNAi的作用進(jìn)一步放大，最終將靶mRNA完全降解。9精選課件ppt10精選課件ppt11精選課件ppt3.RNA干擾現(xiàn)象具有以下幾個(gè)重要的特征

①RNAi是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制；②RNAi具有很高的特異性，只降解與之序列相應(yīng)的單個(gè)內(nèi)源基因的mRNA；③RNAi抑制基因表達(dá)具有很高的效率，表型可以達(dá)到缺失突變體表型的程度，而且相對(duì)很少量的dsRNA分子(數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于內(nèi)源mRNA的數(shù)量)就能完全抑制相應(yīng)基因的表達(dá)，是以催化放大的方式進(jìn)行的；

12精選課件ppt④RNAi抑制基因表達(dá)的效應(yīng)可以穿過細(xì)胞界限，在不同細(xì)胞間長距離傳遞和維持信號(hào)甚至傳播至整個(gè)有機(jī)體以及可遺傳等特點(diǎn);⑤dsRNA不得短于21個(gè)堿基，并且長鏈dsRNA也在細(xì)胞內(nèi)被Dicer酶切割為21bp左右的siRNA，并由siRNA來介導(dǎo)mRNA切割。而且大于30bp的dsRNA不能在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)特異的RNA干擾，而是細(xì)胞非特異性和全面的基因表達(dá)受抑和凋亡；⑥ATP依賴性：在去除ATP的樣品中RNA干擾現(xiàn)象降低或消失顯示RNA干擾是一個(gè)ATP依賴的過程。13精選課件ppt

3.RNA干擾的應(yīng)用

3.1研究基因功能的新工具

由于RNAi具有高度的序列專一性和有效的干擾活力，可以特異地使特定基因沉默，獲得功能喪失或降低突變，因此可以作為功能基因組學(xué)的一種強(qiáng)有力的研究工具。已有研究表明RNAi能夠在哺乳動(dòng)物中抑制特定基因的表達(dá)，制作多種表型，而且抑制基因表達(dá)的時(shí)間可以控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng)。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，這一技術(shù)具有投入少，周期短，操作簡單等優(yōu)勢，近來RNAi成功用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的報(bào)道日益增多，標(biāo)志著RNAi將成為研究基因功能不可或缺的工具。14精選課件ppt3.2病毒性疾病的治療

加州大學(xué)洛杉磯分校和加州理工學(xué)院的研究人員開發(fā)出使用RNAi技術(shù)來阻止艾滋病病毒進(jìn)入人體細(xì)胞。這個(gè)研究小組設(shè)計(jì)合成的lenti病毒載體引入siRNA，激發(fā)RNAi使其抑制了HIV-1的coreceptor-CCR5進(jìn)入人體外周Ｔ淋巴細(xì)胞，而不影響另一種HIV-1主要的coreceptor-CCR4，從而使以lenti病毒載體為媒介引導(dǎo)siRNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生了免疫應(yīng)答，由此治療HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。

15精選課件pptRNAi還可應(yīng)用于其它病毒感染如脊髓灰質(zhì)炎病毒等，siRNA已證實(shí)介導(dǎo)人類細(xì)胞的細(xì)胞間抗病毒免疫，用siRNA對(duì)Magi細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理可使其對(duì)病毒的抵抗能力增強(qiáng)。16精選課件ppt在全世界約30個(gè)國家和地區(qū)散發(fā)或流行的嚴(yán)重急性呼吸綜合征(severeacuterespiratorysyndrome，SARS)的防治研究中，RNAi也受到了重視。17精選課件pptsiRNA在感染的早期階段能有效地抑制病毒的復(fù)制，病毒感染能被針對(duì)病毒基因和相關(guān)宿主基因的siRNA所阻斷，這些結(jié)果提示RNAi能勝任許多病毒的基因治療，RNAi將成為一種有效的抗病毒治療手段。這對(duì)于許多嚴(yán)重的動(dòng)物傳染病的防治具有十分重大的意義。18精選課件ppt

3.3遺傳性疾病的治療

美國西北大學(xué)的CarthewRW和日本基因研究所的IshizukaA等人發(fā)現(xiàn)RNAi同脆性Ｘ染色體綜合征（與FMR-1基因異常有關(guān)的導(dǎo)致智力低下的染色體?。┲g的關(guān)系密切，揭示了與RNAi相關(guān)機(jī)制的缺陷可能導(dǎo)致人類疾病的病理機(jī)制。遺傳性疾病的RNAi治療成為當(dāng)今研究RNAi的又一大熱點(diǎn)。19精選課件ppt3.4腫瘤病的治療

腫瘤是多個(gè)基因相互作用的基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控的結(jié)果，傳統(tǒng)技術(shù)誘發(fā)的單一癌基因的阻斷不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長，而RNAi可以利用同一基因家族的多個(gè)基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設(shè)計(jì)針對(duì)這一區(qū)段序列的dsRNA分子，只注射一種dsRNA即可以產(chǎn)生多個(gè)基因同時(shí)剔除的表現(xiàn)，也可以同時(shí)注射多種dsRNA而將多個(gè)序列不相關(guān)的基因同時(shí)剔除。Maen等應(yīng)用R