王鏡巖生物化學(xué)-第35章 DNA的重組與基因工程1

王鏡巖生物化學(xué)-第35章DNA的重組與基因工程目錄DNA重組技術(shù)基因工程工具酶基因克隆與表達(dá)基因工程的應(yīng)用01DNA重組技術(shù)限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶能夠識(shí)別DNA的特異序列，并在該序列處進(jìn)行切割，形成具有特定黏性末端的DNA片段。T4DNA連接酶T4DNA連接酶能夠?qū)蓚€(gè)具有互補(bǔ)黏性末端的DNA片段連接起來，形成重組的DNA分子。DNA的切割與連接質(zhì)粒是一種自我復(fù)制的DNA分子，常被用作基因克隆和表達(dá)的載體。選擇合適的質(zhì)粒載體需要考慮其復(fù)制特性、抗性標(biāo)記、多克隆位點(diǎn)等因素。噬菌體載體利用噬菌體的感染和復(fù)制特性，將外源DNA插入到噬菌體基因組中，從而實(shí)現(xiàn)外源DNA的擴(kuò)增和克隆。載體的選擇與處理噬菌體載體質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化重組DNA分子被導(dǎo)入到受體細(xì)胞中，通過受體細(xì)胞的復(fù)制和擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)和克隆。篩選通過特定的篩選方法，從眾多的受體細(xì)胞中篩選出含有目的基因的陽(yáng)性克隆，常用的篩選方法包括抗性篩選、雜交篩選和PCR篩選等。重組DNA的轉(zhuǎn)化與篩選02基因工程工具酶123是一類能識(shí)別并附著特定的核苷酸序列，并對(duì)每條鏈中特定部位的兩個(gè)脫氧核糖核苷酸之間的磷酸二酯鍵進(jìn)行切割的酶。限制性核酸內(nèi)切酶根據(jù)限制酶切割位點(diǎn)的不同，可以分為EcoRⅠ、HindⅢ等。分類在基因工程中，限制性核酸內(nèi)切酶主要用于獲取目的基因和載體DNA的線性片段，為隨后的DNA重組提供條件。作用限制性核酸內(nèi)切酶03作用在基因工程中，DNA連接酶主要用于將目的基因和載體DNA重新組合，形成重組DNA分子。01DNA連接酶能夠連接兩個(gè)DNA片段，重新形成磷酸二酯鍵的酶。02分類T4DNA連接酶是一種常用的DNA連接酶。DNA連接酶DNA聚合酶能夠?qū)蝹€(gè)脫氧核苷酸聚合形成DNA鏈的酶。分類TaqDNA聚合酶是一種耐熱的DNA聚合酶，常用于PCR技術(shù)。作用在基因工程中，DNA聚合酶主要用于DNA的復(fù)制和擴(kuò)增。DNA聚合酶其他工具酶其他工具酶包括堿性磷酸酶、末端轉(zhuǎn)移酶、多聚尿嘧啶化酶等。作用這些工具酶在基因工程中起到輔助作用，如去除不需要的磷酸基團(tuán)、添加特定的核酸末端或降解不完整的RNA等。03基因克隆與表達(dá)將特定的基因片段與載體DNA連接，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，形成基因文庫(kù)，用于篩選目的基因?；蛭膸?kù)的構(gòu)建通過特異性引物擴(kuò)增目的基因片段，實(shí)現(xiàn)基因克隆。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再通過克隆技術(shù)獲得目的基因。反轉(zhuǎn)錄法基因克隆的方法在細(xì)菌等原核生物中表達(dá)外源基因，產(chǎn)物多為包涵體。原核表達(dá)系統(tǒng)真核表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控在酵母、昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞等真核生物中表達(dá)外源基因，產(chǎn)物多為分泌型或膜蛋白。通過啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等調(diào)控元件調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄效率，從而控制基因表達(dá)。030201基因的表達(dá)方式利用抗原-抗體反應(yīng)、生物活性檢測(cè)、放射自顯影等技術(shù)檢測(cè)目的基因的表達(dá)產(chǎn)物。檢測(cè)方法通過離心、沉淀、萃取、凝膠電泳等技術(shù)將目的基因產(chǎn)物從細(xì)胞或培養(yǎng)液中分離出來，再進(jìn)行純化。分離純化基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)與分離純化04基因工程的應(yīng)用基因工程藥物是指利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)的治療性蛋白質(zhì)或多肽類藥物，具有高效、特異性強(qiáng)、副作用小等優(yōu)點(diǎn)。目前已經(jīng)上市的基因工程藥物主要包括胰島素、人生長(zhǎng)激素、促紅細(xì)胞生成素等，這些藥物在糖尿病、侏儒癥、腎性貧血等疾病的治療中發(fā)揮了重要作用?；蚬こ趟幬锏纳a(chǎn)過程包括目的基因的獲取、載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞培養(yǎng)和蛋白質(zhì)分離純化等步驟?；蚬こ趟幬锏拈_發(fā)基因治療是指將外源正常基因?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償缺陷和異常基因引起的疾病，以達(dá)到治療目的?；蛑委煹姆椒òɑ蛑脫Q、基因修正、基因沉默等，其中基因沉默是最為常用的方法?；蛑委熢谶z傳性疾病、腫瘤、感染性疾病等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，目前已經(jīng)取得了一些突破性的成果?；蛑委?23基因工程在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用主要包括抗蟲、抗病、抗除草劑等轉(zhuǎn)基因作物的培育和改良。通過將外源抗蟲、抗病和抗除草劑基因?qū)胱魑锛?xì)胞，可以獲得具有優(yōu)良性狀的轉(zhuǎn)基因作物，提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前，轉(zhuǎn)基因作物已經(jīng)在全球范圍內(nèi)廣泛種植，成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要方向之一?；蚬こ淘谵r(nóng)業(yè)上的應(yīng)用基因工程在工業(yè)上的應(yīng)用主要包括微生物代謝工程和蛋白質(zhì)工程等領(lǐng)域。通過基因工程技術(shù)可以改變微生物的代謝途徑，提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量和純度，實(shí)現(xiàn)高效、低成本