飼料中膽汁酸的測定 編制說明

3《飼料中膽汁酸的測定》編制說明膽甾烷-24-酸;豬脫氧膽酸;異去氧膽酸、二羥基膽基酸;3β,6α-二羥基膽烷酸;臭微腥。略溶于醇，丙酮中微溶，乙醚、氯仿鵝去氧膽酸（Chenodeoxycholicaci），羥基-5-β-膽烷酸，脫氧鵝膽酸；無色針狀結(jié)晶。幾乎不溶于水，易溶于乙醇、4兩種類型。初級膽汁酸：在肝細胞以膽固醇為原料直接合成的膽汁酸，包括膽脫氧膽酸(優(yōu)思弗)、TUDCA?；切苊撗跄懰?滔羅特),親水性膽汁酸對肝GCDCA甘氨鵝脫氧膽酸、LCA石膽酸(疏水性最強),疏水性膽汁酸具有細高露等人在以白羽肉雞基礎(chǔ)飼糧中添加300mg/kg的膽汁酸，在1~42齡期5馬志茹等人[3]在歐洲鰻鱺幼魚飼料中添加500mg/kg膽汁酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)膽汁酸可以降低歐洲鰻鱺幼魚肝臟中脂肪合成酶水平和增加脂肪分解酶活性,上調(diào)肝臟磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰膽堿含量,主要增強甘油磷脂代謝和甘油酯代謝,對于膽汁酸(膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸)的檢前衍生-高效液相色譜法、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法、高效液相色譜電霧式檢測器法、高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測器法等[4-14]。2020年1月，中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第257號：根據(jù)《飼料和飼料添）；6合型飼料添加劑中膽汁酸的測定容量法》。該標準只能檢測總的膽汁酸含量，薦性國家標準計劃及相關(guān)標準外文版計劃的通知”78準方法設(shè)計合理，實用有效。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的檢出限、定量限、標準曲9（一）標準編制原則和分析效率為總原則，反映科學技術(shù)的先進成果和先程中嚴格遵循國家有關(guān)方針、政策、法規(guī)和規(guī)章，5009.1-2003《食品衛(wèi)生檢驗方法理化部分總則》和GB/T2到：技術(shù)內(nèi)容的敘述正確無誤；文字表達準確、準的內(nèi)容便于檢測機構(gòu)和生產(chǎn)企業(yè)使用，并且易于關(guān)于膽汁酸檢測相關(guān)的標準有團體標準《T/SDFA037-2023混合型飼料添加劑中膽汁酸的測定容量法》，上述滴定方法僅為膽汁酸總量的測定，無法區(qū)分質(zhì)大多為水產(chǎn)品可食部分、藥品和生物代謝物，對飼料中膽汁酸(膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸)的含量測定研究較少。飼料基質(zhì)更為復雜，飼料基質(zhì)有多大本文件描述了飼料中膽汁酸(膽酸、豬去氧膽酸2.2.3.1液質(zhì)確證方法(1)質(zhì)譜條件的優(yōu)化膽酸、豬脫氧膽酸、鵝脫氧膽酸分子結(jié)構(gòu)見圖1,三種化合物均含有羧基，更易丟失一個氫離子，故采用負離子模式。采用50%(v/v)甲醇水溶液稀釋標(2)液相色譜條件的優(yōu)化分別考察使用0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈為流動相時3種化合物的峰型，如圖2所示；當以甲醇和水為流動相時，色譜圖如圖3所示。經(jīng)過比較可以發(fā)現(xiàn)，以0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈為流動相時，膽酸峰型不好，豬酸和鵝去氧膽酸目標物質(zhì)完全分離，并保證3個化合物的響應值均有提高，且圖20.1%甲酸水溶液和乙腈為流動相的色譜圖圖4乙腈水為流動相的色譜圖時間(min)0）；圖5膽汁酸(膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸)總離子色譜(TIC)圖圖7鵝脫氧膽酸標準溶液(100ng/mL)選擇離子MRM色譜圖圖8豬脫氧膽酸標準溶液(100ng/mL)選擇離子MRM色譜圖(3)基質(zhì)效應膽汁酸是一類強極性弱酸性化合物，膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸之間250x4.6mm、SUPELCODiscoveryHS-C185μm,250x4.6mm2種色譜柱的分離情況分離柱。AgilentEC-C184μm,250x4.6mm柱雖能較好的分開三個化合物，看音時間[min](2)流動相的確定水相的優(yōu)化：高效液相色譜中流動相的配比是影響目標化合物分離的主要因素。試驗比較了0.1%乙酸水溶液、0.1%磷酸水溶液和0.8mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液(pH=3.0)為水相，乙腈作為有機相等不同流動相組合下，三種化合物的分離情況。實驗表明在相同濃度下，0.1%乙酸水溶液-乙腈體系下，膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸雖能有效分離，但流動相干擾現(xiàn)象明顯，無法達到10mg/kg的0.1%磷酸水和0.8mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液(pH=3.0)作為水相可以增強膽汁酸在紫外檢測器下的響應值。同時考慮到緩沖鹽溶液對色譜柱和儀器系統(tǒng)產(chǎn)生影響，最終選擇0.1%磷酸水溶液作水相，乙腈作為有機相。不同流動相的液相色譜圖如圖11-13?？磿r間[min]音圖130.1%磷酸水溶液為水相時的色譜圖命，因此選擇乙腈為有機相。不同有機相的分言看時間[min]圖15甲醇為有機相時的色譜圖流動相比例的優(yōu)化：當有機相的比例大于55%時不夠(如圖16);當乙腈的比例小于45%時，膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸峰形較差(如圖17)。流動相比例在50%左右，能得到最穩(wěn)定的分離效果。三個化合物在6次平行性試驗得出的出峰時間的偏差在2.5%以內(nèi)(如圖18)。因此流動相梯度，在分離三個化合物階段的梯度比例定為1:1.看圖16乙腈比例為55%時色譜圖圖17乙腈比例為45%時色譜圖看時間[min]圖18乙腈比例為50%時色譜圖(3)檢測器的確定3mg/kg,定量限10mg/kg。同時根據(jù)2014年7月，中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2131號；在肉仔雞配合飼料膽汁酸的添加量范圍為60~80mg/kg。最終選取了的檢出限為3mg/kg,定量限為10mg/kg;詳見圖23-25。圖19蒸發(fā)光散射檢測器下10mg/kg膽汁酸色譜圖圖20蒸發(fā)光散射檢測器下20mg/kg膽汁酸色譜圖者圖21PDA檢測器3mg/kg膽汁酸的液相色譜圖晉圖23膽酸標準品PDA光譜圖圖24豬去氧膽酸標準品PDA光譜圖經(jīng)過上述優(yōu)化，最終確定的液相參考條件如下：e)流動相：A相為0.1%磷酸溶液，f)檢測器條件：檢測波長192nm。B相為乙腈，梯度洗脫如表3。表3梯度洗脫程序時間(min)0.1%磷酸水溶液(%)(3)提取溶劑的優(yōu)化：膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸易溶于醇、乙酸乙酯、乙酸，微溶于水。比較了甲醇、0.1%乙酸甲醇、乙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷作為提取劑的提取效率。試驗結(jié)果表明三氯甲烷不能提取出膽汁酸；乙酸乙酯雖能提取膽汁酸，但在提取水產(chǎn)用添加劑預混合飼料時回收率小于50%。乙醇和甲醇溶液的提取效果無明顯差異，但乙醇沸點高，且與水易形成共沸，不易濃縮。加入適量乙酸，有助于膽汁酸形成酸，被提取溶劑提取出來，試驗結(jié)果表明0.1%乙酸甲醇比單純的甲醇，回收率可以提高10%左右。綜合考慮，最終選取0.1%乙酸甲醇做為提取溶劑，圖26三氯甲烷提取液相色譜圖圖290.1%乙酸甲醇提取液相色譜圖(5)凈化條件的優(yōu)化：為提高上機濃度，嘗試了取5g樣品，提取溶劑提取后，將提取液全部濃縮但無法避免飼料基質(zhì)的影響，采用不同的基質(zhì)，回收率在50~95%之間波動。為實際驗證，最后采取了HLB固相萃取柱(6mL/500mg)凈化，回收率在80-100%儲備溶液(4mg/mL),分別在剛配制完、3個月、6個月時取出。每次試驗時，對標準偏差(RSD)均小于10%。試驗結(jié)果表明，標準儲備溶液在-18℃下保存6個月是穩(wěn)定的，見表4。表4.標準儲備溶液穩(wěn)定性試驗結(jié)果時間(月)036分別移取適量膽汁酸標準中間溶液，用50%乙腈溶液定容，配制成濃度為表5膽汁酸的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)線性范圍/(μg/L）2r圖30膽酸標準曲線圖32豬去氧膽酸標準曲線取標準中間溶液適量，用流動相稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為50mg/L、豬去氧膽酸標準曲線的相關(guān)系數(shù)R2為0.99964,鵝去氧膽酸標準曲線的相關(guān)系數(shù)表6膽汁酸的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)線性范圍/(mg/L)圖33膽酸標準曲線圖35鵝去氧膽酸標準曲線3.3檢出限和定量限飼料基質(zhì)復雜，因此，本試驗選擇水產(chǎn)用(魚)、禽用(雞)2類基質(zhì)(添加劑預混合飼料、配合飼料、濃縮飼料)共5種飼料作為考察對象。在上述空白飼料中添加一定濃度的膽汁酸對照品，按照本標準進行試驗。依據(jù)信號與噪聲比例，即s/n≥3的濃度為檢出限，s/n≥10的濃度為定量限的原則。第一法液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢出限為0.03mg/kg,定量限為0.1mg/kg;第二法液相色譜法檢出限為3mg/kg,定量限為10mg/kg。2盛圖45液相色譜法-雞預混合飼料空白基質(zhì)液相色譜圖晉），方法的回收率及精密度均符合GB/T2318方法的回收率及精密度均符合GB/T2318表7雞預混合飼料基質(zhì)的加標回收率和相對標準偏差（n=6）123456法酸酸添加濃度(μg/kg）法酸酸表8雞配置飼料基質(zhì)的加標回收率和相對標準偏差（n=6）基質(zhì)123456雞配置飼料法酸酸添加濃度(μg/kg）法酸酸表9水產(chǎn)預混合飼料基質(zhì)的加標回收率和相對標準偏差（n=6）基質(zhì)目123456水產(chǎn)預混合法飼料添加濃度(μg/kg）法表10水產(chǎn)配置飼料基質(zhì)的加標回收率和相對標準偏差（n=6）123456法酸酸添加濃度(μg/kg）法酸酸表11水產(chǎn)濃縮飼料基質(zhì)的加標回收率和相對標準偏差（n=6）123456液相色譜法酸酸添加濃度(μg/kg）液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法酸酸業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所等3家單位對標準方法的線性與范經(jīng)上述方法學驗證，該方法可以用膽汁酸(膽含量的測定。同時，膽汁酸在液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜色譜條件下線性范圍為10-500方法的回收率及精密度均符合GB/T2318[1]YangLiu,Md.AbulKalamAzad,ujuanDing1,etal.Dietarybileacidsupplementationinweanedpigletswithintrauterinegrowthretardationimprovescolonicmicrobiota,metabolicactivity,andepithelialfunction[J].JournalofAnimalScienceandBiotechnology,(2023)14:99[2]劉太亮.膽汁酸在河蟹養(yǎng)殖中的應用[J].漁業(yè)進展雜志,2017,9：83-84.[3]馬志茹,趙盼月,翟少偉.飼料中添加膽汁酸對歐洲鰻鱺幼魚肝臟脂肪代謝的影響[J].水生生物學報,2023,3(47)：515-522.[4]唐元軍，陳育琳，陳慶輝.HPLC-ELSD法同時測定豬膽粉中豬去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量[J].中藥新藥與臨床藥理,2010,21（6）：651-653.[5]李志萬，馬強，袁永生，等.HPLC-ELSD法對豬膽粉中豬去氧膽酸的含量測定研究[J].中國實驗方劑學雜志，2005,11（5）：14-16.[6]彭燦，呂蒙瑩，李耕，等.牛黃及其代用品膽酸類物質(zhì)分析方法研究進展[J].中草藥,2013,44（5）：632-636.[7]范艷美，賈夢杰，劉培培，等.豬膽粉中豬去氧膽酸的提取、鑒定和含量測定[J].廣州化工,2017,45（15）：148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