DB13-T1384-4-2011飼料中新霉素的測(cè)定

ICS65.120

B46

DB13

河北省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB13/T1384.4—2011

飼料中新霉素的測(cè)定

Determinationofneomycininfeed

DB13/T1384.4—2011

飼料中新霉素的測(cè)定

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了飼料中新霉素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于飼料中新霉素的測(cè)定。

本標(biāo)準(zhǔn)的方法檢出限為40μg/kg。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法（GB/T6682－1992，neqISO3696:1987)

3原理

試樣經(jīng)提取，高速離心后再用CBX固相萃取小柱凈化，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，子離子豐度比定

性，外標(biāo)法定量。

4試劑和材料

除另有說明外，所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。

4.1甲醇：色譜純。

4.2七氟丁酸酐（HFBA）：優(yōu)級(jí)純。

4.3三氯乙酸。

4.4磷酸二氫鉀（KH2PO4）。

4.5鹽酸。

4.6二水合乙二胺四乙酸二鈉（Na2EDTA·2H2O）。

4.7樣品提取液（10mmol/LKH2PO4溶液，含0.4mmol/LEDTA和2％三氯乙酸）：準(zhǔn)確稱量1.36g

KH2PO4于1000mL容量瓶中，加入少量水，用鹽酸調(diào)pH至4.0，再加入1.5gNa2EDTA·2H2O和

20g三氯乙酸，用水定容至刻度，混勻即得。

4.8氫氧化鈉

4.9新霉素標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99％。。

4.10新霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：分別稱取經(jīng)折算相當(dāng)于0.0100g新霉素的標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解定容至100

mL，溶液濃度為100g/mL。1℃～4℃冷藏保存，保存期1個(gè)月。

4.11空白樣品提取液：用不含鏈霉素的樣品，按照6.1和6.2制備空白樣品溶液。

4.12新霉素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：根據(jù)需要用空白樣品溶液將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成15ng/mL、25ng/mL、50

ng/mL、250ng/mL、300ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，相當(dāng)于樣品中含有6g/kg、10g/kg、20g/kg、

100g/kg、120g/kg新霉素，現(xiàn)配。

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DB13/T1384.4—2011

4.13CBX陽離子交換柱，或相當(dāng)者：500mg，6mL。

4.14乙酸。

4.1510％乙酸甲醇溶液：準(zhǔn)確量取10mL乙酸于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻即可。

4.16100mmol/LHFBA水溶液：準(zhǔn)確量取6.5mL七氟丁酸酐，用水稀釋至500mL（4℃避光保存

6個(gè)月）。

4.1720mmol/LHFBA水溶液：準(zhǔn)確量取100mmol/LHFBA溶液50mL，用水稀釋至250mL（4℃

避光保存6個(gè)月）。

4.185mmol/LHFBA水溶液：準(zhǔn)確量取20mmol/LHFBA溶液25mL，用水稀釋至100mL（4℃避

光保存6個(gè)月）。

4.1920mmol/LHFBA乙腈溶液：準(zhǔn)確量取1.3mL七氟丁酸酐，用乙腈稀釋至500mL（4℃避光保

存6個(gè)月）。

5儀器和設(shè)備

5.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源。

5.2微孔濾膜。

5.3pH計(jì)。

5.4高速離心機(jī)。

5.5旋渦混勻器。

5.6固相萃取裝置。

6測(cè)定步驟

6.1提取

準(zhǔn)確稱取樣品1g（精確到0.01g）至10mL離心管中，加樣品提取液10mL，旋渦混勻10min，

12000r/min離心10min，移出上清液。重復(fù)提取一次，合并上清液，調(diào)pH至8.0，12000r/min離

心10min，取上清液備用。

6.2凈化

將上清液移入CBX柱（使用前分別用5mL甲醇、5mL水預(yù)處理，保持柱體濕潤）。溶液以2.0mL

/min的流速過柱，然后依次用水淋洗，減壓抽干20min。用10％乙酸甲醇溶液5mL洗脫，收集洗脫液

于40℃下氮?dú)獯蹈伞Ｓ?mmol/LHFBA水溶液0.5mL溶解殘?jiān)?5000r/min離心10min，經(jīng)0.22

μm濾膜過濾后，待測(cè)。

6.3測(cè)定

6.3.1液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜柱：C18，5μm，50mm×2.lmm（內(nèi)徑）或相當(dāng)者。

流動(dòng)相：20mmol/LHFBA水溶液（A）＋20mmol/LHFBA乙腈溶液（B）。

流速：0.25mL/min。

梯度：0min～10.0min5％～60％B，10.0min～10.1min60%～5%B，10.1min～15.0min5％

B。

柱溫：30℃。

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DB13/T1384.4—2011

進(jìn)樣量：10μL。

離子源：電噴霧離子源。

掃描方式：正離子掃描。

檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)。

電噴霧電壓、碰撞電壓等自動(dòng)優(yōu)化至最佳值。

定性離子對(duì)(m/z)：615.6/160.9，615.6/293.1。

定量離子對(duì)(m/z)：615.6/160.9。

6.3.2色譜測(cè)定

根據(jù)試樣中被測(cè)樣液的含量情況，選取響應(yīng)值相近的標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行色譜分析。標(biāo)準(zhǔn)工作液和樣液

中待測(cè)物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器線性響應(yīng)范圍內(nèi)。新霉素標(biāo)準(zhǔn)品多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）色譜圖參見附錄A。

6.4定性、定量

按照液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件測(cè)定樣品和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，如果檢測(cè)的質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品

一致，定量測(cè)定時(shí)采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。定性時(shí)應(yīng)當(dāng)與濃度相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的相對(duì)豐度一致，相對(duì)豐度允

許偏差不超過表1規(guī)定的范圍，則可判斷樣品中存在對(duì)應(yīng)的被測(cè)物。

表1定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差

相對(duì)離子豐度/(％)＞50＞20至50＞10至20≤10

允許的相對(duì)偏差/(％)±20±25±30±50

6.5空白試驗(yàn)

除不加試樣外，均按上述操作步驟進(jìn)行。

7結(jié)果計(jì)算和表述

用色譜數(shù)據(jù)處理機(jī)或用標(biāo)準(zhǔn)曲線按式（1）計(jì)算試樣中新霉素含量：

c×V

X=……….(1)

m×1000

式中：

X一一試樣中新霉索的量，單位為毫克每千克（mg/kg）；

c一一從標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到的待測(cè)液中新霉素的濃度，單位為納克每毫升（ng/mL）；

V——樣液最終定容體積，單位為毫升（mL）；

m——最終樣液代表的試樣質(zhì)量，單位為克（g）。

8精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的15％。

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DB13/T1384.4—2011

AA

附錄A

（資料性附錄）

MRM色譜圖

圖A.1新霉素的MRM色譜圖

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DB13/T1384.4—2011

前言

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1－2009給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)由河北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局提出。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：河北省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院、石家莊市疾病預(yù)防控制中心、北京出入境檢驗(yàn)

檢疫技術(shù)中心、河北醫(yī)科大學(xué)、河北省飼料產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：張巖、張宏、李揮、楊立學(xué)、叢斌、盧曉宇、呂品、李志平、沈磊、賈茜、馬

春玲、米振杰、李強(qiáng)、高振同、武英利。

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DB13/T1384.8—2011

AA

附錄A

（資料性附錄）

氯羥吡啶標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖

表A.1氯羥吡啶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)譜圖

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