（整理）分子實驗學(xué)習(xí)總結(jié)-郁娟娟

（整理）分子實驗學(xué)習(xí)總結(jié)——郁娟娟DNAstar：序列拼接MEGA：分析堿基組成CLUSTAL：序列比對PAUP：跑樹DABE：飽和性分析總思路：序列拼接-比對-四、下載序列的方法打開.Fasta格式的序列-Fileexport-sequancealignment-保存在NCBI上找到相應(yīng)的序列方法：SearchNucleotidefor文章的genibank序列號-reports-復(fù)制序列到txt文件中，刪除沒用的東西，只留下序列和學(xué)名。保存成txt文件后，打開Editseq-將,txt序列復(fù)制到其中-save保存為seq格式五、將拼接序列翻譯成蛋白質(zhì)方法打開拼接的序列-全選中-Goodies-translateDNA2、如何計算堿基含量比值、答：MEGA-NucleotideComposition六、DAMBE序列飽和性分析序列的飽和性分析在DAMBE程序中，以轉(zhuǎn)換、顛換數(shù)為縱軸，以TN93模型（TamuraandNei,1993）校正的距離為橫軸做散點圖。如果這些點隨序列間分歧增大呈線性分布就說明序列間替換沒有達到飽和，序列可以用于后續(xù)的系統(tǒng)發(fā)育分析。DAMBE還長用在單倍型的歸納、基因頻率和堿基組成分析、遺傳距離計算、序列排序、5.2.2堿基替換飽和效應(yīng)的檢驗當(dāng)核苷酸序列分歧較小時，序列之間被觀察到的核苷酸差異數(shù)接近實際替換數(shù)。如果序列分歧較大，DNA序列的變異可能會受到飽和效應(yīng)的影響，這時觀察到的堿基差異可能包含了部分進化雜音。一般說來，堿基轉(zhuǎn)換發(fā)生的頻率高于顛換，但是隨物種分歧程度的增加，轉(zhuǎn)換/顛換的比率接近或小于1，說明轉(zhuǎn)換可能已經(jīng)趨于飽和并可能成為進化雜音，所以轉(zhuǎn)換和顛換發(fā)生的頻率與序列間分歧度的關(guān)系就可以反映出堿基替換是否受飽和效應(yīng)的影響。在著手構(gòu)建分子系統(tǒng)樹前，為了排除這種進化雜音獲取正確的進化信息，必須對目的片段的堿基替換是否受到飽和效應(yīng)的影響進行檢驗。用DAMBE（Xia，2000）分別對四個mtDNA片段的堿基替換模式進行檢測，以此估計所研究mtDNA片段的堿基替換是否受到飽和效應(yīng)的影響。打開DAMBE-FILE-Openstandardsequencefile-類型unknown-打開proteincodingnuc.seq-invMtdna-trains-table–go-graphics-trainsitionandtranversionversisadvance–tn93-g0-graphstyle-curveonly-保存.bmp問題1、如何計算密碼子的不同位上堿基變化，轉(zhuǎn)換顛換比值2、如何進行序列的飽和性分析序列的飽和性分析在DAMBE程序中，以轉(zhuǎn)換、顛換數(shù)為縱軸，以TN93模型（Tamura&Nei,1993）校正的距離為橫軸做散點圖。如果這些點隨序列間分歧增大呈線性分布就說明序列間替換沒有達到飽和，序列可以用于后續(xù)的系統(tǒng)發(fā)育分析。3、如何看用Editseq檢驗拼接后的序列是否能正確翻譯為蛋白質(zhì)4、如何計算遺傳距離（DAMBE）一、DNAstar：序列拼接在序列的拼接時，修改紅色和小寫字母的堿基具體步驟：1、ABI文件包括圖形和序列、SEQ文件只有序列沒有圖。2、DNAstar—seqman—File—NEW，把序列都放近去，有兩個正向，倆個反向的序列—Timeends—LOW—SEANALL-ASSEMBLE–出現(xiàn)contig打開-雙擊contig_@_核對-contig-saveconsenus-singlefile-保存位置-sequce-add-選擇保存到的位置-點序列名字-add-雙擊-拼接完關(guān)閉。3、原始序列和拼接的序列各保存在一個文件夾內(nèi)。4、EDIT-GOODIES-TRALS翻譯成蛋白質(zhì)?！?、從ncbi上下載相關(guān)的序列和測得的序列保存在一個文件夾內(nèi)，把前面的內(nèi)容都刪除，保留種名。加〉符號-保存二、序列的比對6、先切齊序列：用Seqman-sequence-add-skip-把所有的序列加進去進行刪除，使序列整齊。-contig雙擊,將序列切齊，再復(fù)制到一個新建的文本文檔。7、切齊后保存方式：contig-exportsequences-multiplefiles=setlocation-file-保存切齊8、當(dāng)在切齊的序列中發(fā)現(xiàn)反向序列要改正：用editseq打開序列-selectall–goodies-resersecomplement-全選粘貼到文本文檔中，目的是比對。三、構(gòu)建NJ樹方法(MEGA)1、將TXT格式保存為nexus和clustal格式（生成aln\dnd\nxs）CLUSTAR-進行比對-FILE-LOADSEQUENCE-打開新建的文本文檔txt-加入進去后-aligment-docompleteAlignment-File-Savesequenceas–format-custal-ok-File-Savesequenceas–format-NEXUS最后保存為nexus和clustal格式，NEXUS是PAUP格式-關(guān)閉clustal.2、點擊MEGA-File-opendata-.aln文件-打開-ok-點擊向下的綠色圖標-ok-ok-刪除最后沒用的東西-保存-切齊序列,meg-3、點擊MEGA-File-opendata-切齊序列,meg-ok-yes-inverttebrateMitochondrial-ok-4、phylogency-constructphylogency-NJ樹-none改成bootstrap-k2p-compute-保存（image-EMF）5、使用Mega2.0分析序列間的p-distance,即兩兩序列間的核酸差異比例，分析序列變異情況方法1：Distance-computepairwise-distanceonly改為stderr-compute方法2：pattern-computecompositiondistance三、構(gòu)建MP樹方法1、MrBays，目的是轉(zhuǎn)化為.nex文件步驟為：用bioedit將.txt文件比對轉(zhuǎn)換成.nex文件格式方法：打開BioEdit，將.txt文件打開-Accessoryapplication-clustalmultiplealignment-File-export-sequenceAligment-選paup/nex命令.nex-保存-把.nexbegin前面的都刪除。File-open-切齊序列.txt-accessoryappliacation-clustalmultiplealigment-file-expore-sequencealigment-選paup/nenu命名.nex-保存2、在.nex中加命令模板;end;beginpaup;logfile=coimp;setmaxtrees=1000;setcriterion=parsimony;hsearchaddseq=randomnreps=1000;showtrees;describetrees1/plot=phylogrambrlens=yes;savetreesfile=coi(mp).treroot=yesbrlens=yes;contreeall/file=coi.tre;pscoreall/CI=yesRI=yesRC=yes;bootstrapnreps=1000keepall=yessearch=heuristic/addseq=randomnreps=100;savetreesfile=coi(mpb).treroot=yes;END;2、打開paup-打開1.nex-open–開始跑樹3、用treeview打開.tree樹。MrBays建樹1、用bioedit將.txt文件比對轉(zhuǎn)換成.nex文件格式方法：打開BioEdit，將.txt文件打開-Accessoryapplication-clustalmultiplealignment-File-export-sequenceAligment-選paup/nex命令.nex-保存-把.nexbegin前面的都刪除。File-open-切齊序列.txt-accessoryappliacation-clustalmultiplealigment-file-expore-sequencealigment-選paup/nenu命名.nex-保存2、用paup運行.nex文件3、接著繼續(xù)用paup打開modeltest3.7文件夾中的modelpaupblock命令-運行結(jié)束后，在modeltest的modelfolder中生成一文件名為”model.scores”文件。4、運行modeltest批處理文件，生成一文件名為”mt.txt”文件，則為最適合的模型文件5、將最適模型文件中的參數(shù)(hLRTs)拷貝到.nex文件后，加入貝葉斯運行命令，并改正.ne格式等。刪除前后沒用的，改正外群名字等。只能用一個外群。beginmrbayes;logstartfilename=coibayes.log;outgroupCinara;Prsetstatefreqpr=dirichlet(0.3321,0.1058,0.1271,0.435);Lsetnst=6rates=gamma;mcmcngen=1000000printfreq=100nchains=4savebrlens=yesstartingtree=random;end;6、將加好命令的.nex文件拷貝到MrBayes文件夾所在路徑內(nèi)，運行人頭的MrBayes,輸入execute.文件名.net,回車。7、輸入sumpburnin=1000回車8、輸入sumtburnin=1000回車9、運算完畢后點擊close彈出一對話框，輸入命令語句“savetreefile＝文件名.tre；”回車。菜單欄Tree中的Showinternaledgelabels即可顯示各結(jié)點的bootstrap值。9、生成的.con，用treeview打開注意：貝葉斯樹只能用一個外群。建設(shè)一個新文件夾，將.scores、mt.txt、txt、nex文件都放到一個文件夾內(nèi)。ML建樹方法同MrBays相似。預(yù)測模型利用貝葉斯得到的模型。把ML命令模板拷貝到.nex，把logfile改成自己的名(=coiML)，外群也改(Daktulosphaira_vitifoliaeCinara_edulisC_arizonica);-把最適模型lsetbase---likhood下面savetreefile=coisavetreesfile=coin(mb)LsetBase=(0.33650.09760.1280)Nst=6Rmat=(26794342.00008028280.500010365153.00001.4084255543472.0000)Rates=equalPinvar=0.7355;–生成的.nex.con文件-treeview打開。注意：外群要寫成Cinara_edulis形式，可以有多個外群。打開方式和mp樹一致。戴傳銀筆記PAUPNJtreebeginpaup;outgroupoutgroupname;setcriterion=distance;bootstrapsearch=njnreps=1000keepall;savetreesfile=nj.tre;end;PAUPMPTREEbeginpaup;outgroupoutgroupname;setcriterion=parsimony;hsearchaddseq=simple(random)bootstrapnreps=1000;describetrees1/plot=phylogrambrlens=yes;savetreesfrom=1to=1000;end;PAUPMLTREEbeginpaup;outgroupoutgroupname;setcriterion=likelihood;gettreesfile=xxx.tre;(xxxmodeltest文件保存的樹的名稱)hsearchaddseq=asisbootstrapnreps=1000;savetreesfile=ml.tre;end;MEGA3.1分析其核酸組成1、打開MEGA，點擊“File”中的“OpenData”打開“COI.aln”文件，點擊綠色箭頭－“ConverttoMegaformat”快捷鍵，出一把COI.aln轉(zhuǎn)換成Mega格式的對話框，點擊OK，即轉(zhuǎn)換成COI的Megafile，保存。2、用Mega打開該文件。選DataType。Protein－codingnucleotidesequencedata？Yes。SelectgeneticCode。程序自行計算。3、點擊TA圖標，出現(xiàn)SequenceDataExplorerC：Conservedsites291/660,分母613是總位點數(shù)V：Variablesites352/660P:Parsimony-informativesites26/660N:Nonparsimony-informativesites352-26＝326。4、Mega-File-opendate-運算-sequenceDataExplorer-writedatatofile-title-寫名字.nex注意：序列一定要正確，不能是反向的?。。。?！5、打開paup-打開1.nex-open–開始跑樹6、Bootstrap值檢驗及樹的保存輸入命令“bootstrapnreps＝1000keepall＝y(tǒng)essearch＝heuristic/addseq＝randomnreps＝100；”點擊回車鍵，程序開始運算。運算完畢后點擊close彈出一對話框，輸入命令語句“savetreefile＝文件名.tre；”回車。菜單欄Tree中的Showinternaledgelabels即可顯示各結(jié)點的bootstrap值。7、用treeview打開.tree樹。阿征筆記beginpaup;setautoclose=yesnotifybeep=yes;logfile=log.txt;outgroupA00;setroot=outgroupoutroot=monophyl;setcriterion=parsimony;hsearchaddseq=randomnreps=500nchuck=5chuckscore=1;savetreesformat=nexusbrlens=yesappend=yesfile=mp.treroot=yes;contreeall/file=mp(contree).trestrict=nomajrule=yespercent=50le50=yes;bootstrapnreps=1000conlevel=50keepall=nosearch=heuristic/addseq=randomnreps=100;savetreesfile=mp(bootstrap).treroot=yesbrlens=yessavebootp=bothfrom=1to=1000;end;征征20:31:57我每次都是先寫到contree那一步，然后在里面敲命令，后兩條分別征征20:32:13beginpaup;setautoclose=yesnotifybeep=yes;logfile=log.txt;outgroupA00;setroot=outgroupoutroot=monophyl;setcriterion=parsimony;hsearchaddseq=randomnreps=500nchuck=5chuckscore=1;savetreesformat=nexusbrlens=yesappend=yesfile=mp.treroot=yes;contreeall/file=mp(contree).trestrict=nomajrule=yespercent=50le50=yes;end;征征20:32:25然后bootstrapnreps=1000conlevel=50keepall=nosearch=heuristic/addseq=randomnreps=100;征征20:32:36跑完后savetreesfile=mp(bootstrap).treroot=yesbrlens=yessavebootp=bothfrom=1to=1000;征征20:32:54保存一個有bootstrap的樹征征20:33:35再給你個阿榮給我的征征20:33:42setautoclose=yescriterion=parsimonynotifybeep=yes;logfile=...;Hsearchaddseq=randomnreps=100start=stepwisesavereps=yesrandomize=addseqrstatus=yeshold=1swap=tbrmultrees=yes;savetreesformat=nexusbrlens=yesappend=yesfile=...;contreeall/strict=nomajrule=yespercent=50le50=yes;bootstrapnreps=1000conlevel=50keepall=yessearch=heuristic/addseq=randomnreps=10;征征20:34:16對了，我的outroot=monophyl;你們分子不是monophylPAUP軟件使用簡要說明1.數(shù)據(jù)輸入格式將需要分析的一組