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1DB13/Txxxx—2022規(guī)?；膛霾剪斒暇艋夹g規(guī)范本標準規(guī)定了規(guī)模化奶牛場布魯氏菌病的診斷、檢測凈化、生物安全等技術要求。本標準適用于規(guī)模化奶牛場布魯氏菌病的凈化，其他類型的奶牛場布魯氏菌病凈化可參考執(zhí)行。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4143牛冷凍精液GB7959糞便無害化衛(wèi)生要求GB16548病害動物和病害動物產品生物安全處理規(guī)程GB16568奶牛場衛(wèi)生規(guī)范GB18596畜禽養(yǎng)殖業(yè)污染物排放標準GB/T18646-2018動物布魯氏菌病診斷技術NY/T34奶牛飼養(yǎng)標準NY/T1567標準化奶牛場建設規(guī)范NY/T1952動物免疫接種技術規(guī)范NY5030無公害食品畜禽飼養(yǎng)獸藥使用準則NY5045無公害食品生鮮牛乳NY5047無公害食品奶牛飼養(yǎng)獸醫(yī)防疫準則NY/T5049無公害食品奶牛飼養(yǎng)管理準則《畜禽標識與養(yǎng)殖檔案管理辦法》（2006年農業(yè)部令第67號）《動物防疫條件審查辦法》（2010年農業(yè)部令第7號）《乳用動物健康標準》（2008年農業(yè)部公告第1137號）《種用動物健康標準》（農業(yè)農村部）《奶牛標準化規(guī)模養(yǎng)殖生產技術規(guī)范》（農辦牧[2008]第3號）《布魯氏菌病防治技術規(guī)范》（農醫(yī)發(fā)[2007]12號）《動物疫病凈化場評估技術規(guī)范》（疫控監(jiān)函[2021]156號）3術語和定義下列術語和定義適用于本標準。3.1規(guī)?；膛鼍哂歇毩⒎忾]的飼養(yǎng)管理區(qū)，成母牛存欄在100頭以上，取得《動物防疫條件許可證》，管理規(guī)范的奶牛場。3.2凈化標準（非免疫）連續(xù)2年以上無布魯氏菌病臨床病例，布魯氏菌抗體檢測陰性；具備維持凈化狀態(tài)的生物安全及管理條件。3.3生物安全為阻止動物病原體場外傳入、場內傳播和向場外擴散所需的一系列設施和措施。4實驗室檢測方法4.1血清學檢測4.1.1檢測血清樣品虎紅平板凝集試驗（RBT試管凝集試驗（SAT間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（i-ELISA競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗（c-ELISA補體結合試驗（CFT見國標GB/T18646-2018。被檢血清來自布魯氏菌病非免2DB13/Txxxx—2022疫奶?；蚴褂肁19疫苗皮下注射超過18個月或使用S2疫苗口腔噴服接種超過6個月的奶牛。4.1.2檢測乳樣全乳環(huán)狀試驗（MRT見國標GB/T18646-2018。被檢乳樣為新鮮全乳或混合乳，來自的奶牛同4.1.1，但不得為初乳、脫脂乳、煮沸過的乳、凍結乳、腐敗乳、酸化乳、乳房炎及其他乳房疾病患病牛的乳樣。4.1.3免疫血清抗體與自然感染血清抗體鑒別檢測瓊脂凝膠免疫擴散試驗（NH-GD見附錄A。4.2病原學檢測4.2.1樣品采集流產胎兒可無菌采集胎衣、羊水、肝、脾、淋巴結、胃內容物等；流產母牛可無菌采集乳汁、陰道分泌物等。剖檢采樣過程應當防止病原微生物擴散，操作人員應當采取針對性防護措施。4.2.2檢測方法聚合酶鏈式反應（PCR見國標GB/T18646-2018。5診斷5.1病例診斷對流產母牛、流產胎兒，采用4.2.2檢測結果陽性的,判定為病例。5.2感染判定5.2.1對臨床健康奶牛，采用RBT或i-ELISA、MRT中任一方法，檢測結果陽性的判為疑似感染陽性。5.2.2對臨床健康奶牛，采用SAT、c-ELISA、CFT中任一方法檢測結果陽性的，判為感染陽性。5.2.3對免疫布魯氏菌病疫苗未超過4.1.1接種時間的臨床健康奶牛，采用4.1.3檢測結果陽性的，判為感染陽性。6檢測凈化6.1感染狀況調查按照奶?？偞鏅跀怠㈩A期感染率3%、置信度95%確定抽樣數量，并根據泌乳牛、干乳牛、后備牛存欄數量按比例分配，覆蓋到每個棟舍隨機抽樣，同時兼顧不同奶牛品種。采用i-ELISA或RBT方法檢測，掌握牛群布魯氏菌病感染率。6.2確定凈化技術路線6.2.1牛群布魯氏菌病感染率<2%，禁止或停止免疫。全群循環(huán)檢測，隔離淘汰患病?；蚋腥娟栃耘?。6.2.2牛群布魯氏菌病感染率≥2%，可按6.3接種布魯氏菌疫苗，跟蹤檢測感染率<2%后按6.2.1執(zhí)行。6.3免疫程序6.3.1A19疫苗。3月齡~8月齡犢牛使用密閉式連續(xù)注射器皮下注射接種一個標準劑量（6×1010CFU感染嚴重牛群可在首次配種前減量（6×109CFU）接種加強免疫一次。6.3.2S2疫苗。3月齡~8月齡犢牛使用密閉式投藥器口腔噴服接種一個標準劑量（5×1010CFU間隔1個月~2個月加強免疫一次；不建議成年牛接種。6.4檢測方法組合6.4.1串聯(lián)檢測。對于感染率≥2%的奶牛群或在凈化初期，采用i-ELISA或RBT、MRT方法檢測初篩，結果陽性的樣品采用c-ELISA或SAT、CFT方法檢測確診。推薦i-ELISA方法初篩、c-ELISA方法確診組合。6.4.2并聯(lián)檢測。對于感染率<2%的奶牛群或在凈化后期，采用i-ELISA、RBT、MRT、c-ELISA等兩種以上方法平行檢測，任一方法檢測結果陽性或可疑視為感染陽性牛。3DB13/Txxxx—20226.5檢測頻率6.5.1外引牛檢測。引入前在輸出地檢測一次，引入后隔離45d~60d，混群前再檢測一次。6.5.2流產牛檢測。及時對流產母牛進行血清學檢測，對流產物進行病原學檢測。6.5.3感染牛群檢測。每間隔2個月~4個月普檢一次，連續(xù)兩次檢測均為陰性視為假定凈化牛群。6.5.4假定凈化牛群檢測。每間隔4個月~6個月普檢一次連續(xù)兩次檢測均為陰性，視為凈化牛群。檢出陽性牛時按6.5.3執(zhí)行。6.5.5凈化牛群維持檢測。每間隔3個月~6個月抽檢一次，根據凈化狀態(tài)維持情況延長檢測間隔；抽樣方法、抽樣數量和覆蓋范圍參照6.1執(zhí)行，檢出陽性時按6.5.3執(zhí)行。6.6患病牛和感染陽性牛處理。發(fā)現(xiàn)布魯氏菌病患病牛和確診感染陽性牛立即隔離、限制移動，按《布魯氏菌病防治技術規(guī)范》和GB16548的規(guī)定報告、撲殺和處理。7生物安全7.1場區(qū)建設場址選擇符合農業(yè)農村部《動物防疫條件審查辦法》的距離要求，建設標準符合NY/T1567，場區(qū)設計及布局設施符合NY/T682和GB16568的要求。7.2種源管理7.2.1國內引進種用牛、乳用牛、精液、胚胎，應來源于取得《種畜禽生產經營許可證》的單位，優(yōu)先選擇“國家級布魯氏菌病凈化場”，具有《動物檢疫合格證明》、《系譜證》和有資質實驗室部門出具的布魯氏菌病、結核病檢測結果陰性報告和口蹄疫病原學、血清學檢測合格報告。引進的種用牛符合《種用動物健康標準》，乳用牛符合《乳用動物健康標準》，凍精符合GB4143的相關規(guī)定。7.2.2國外引進活牛、精液、胚胎應具有國務院農業(yè)農村主管部門簽發(fā)的審批意見及出入境檢驗檢疫系統(tǒng)出具的《入境貨物檢驗檢疫證明》。7.2.3活牛引入后隔離觀察45d~60d，再進行一次布魯氏菌病檢測，確認陰性方可混群。7.2.4使用精液、胚胎應詳細記錄，必要時使用前再進行一次布魯氏菌病檢測，確認陰性后再使用。7.2.5對外銷售乳用牛、胚胎應提供有資質實驗室出具的布魯氏菌病、結核病檢測陰性報告以及口蹄疫病原學和血清學檢測合格報告。7.3生產管理7.3.1飼養(yǎng)管理。飼養(yǎng)管理、飼養(yǎng)標準符合《奶牛場標準化規(guī)模養(yǎng)殖生產技術規(guī)范》、NY/T5049、NY/T34的要求。堅持自繁自養(yǎng)，禁止飼養(yǎng)其他動物。7.3.2牛奶管理。牛奶出場前自檢、盛裝、貯藏和運輸符合NY5045要求，奶?；疾『退幬餁埩羝陂g的牛奶不得出售。7.3.3追溯管理。奶牛佩戴耳標、建立檔案符合《畜禽標識與養(yǎng)殖檔案管理辦法》要求，保證可追溯到奶牛個體。7.4人員管理7.4.1外來人員無必要禁止進入生產區(qū)。7.4.2本場職工無布魯氏菌病、結核??；每年定期進行健康體檢，上崗職工應取得人獸共患病健康合格證明；建立職工健康檔案。7.4.3本場職工無必要不得串區(qū)、串舍，不得對外兼職，不接觸場外牛、羊等易感動物，禁止帶入場區(qū)生鮮的牛羊肉、乳等風險產品。各功能區(qū)、棟舍的崗位職工相對固定，無必要不串區(qū)、不串舍。7.4.4從事飼養(yǎng)、配種、接產、擠奶、診療、免疫以及保定、佩標、采樣、檢測等與奶牛密切接觸的工作，尤其接觸病牛及其污染物、病料等感染材料時，根據風險程度選擇性穿戴口罩、手套、工作服、護目鏡、面罩等防護用品；不可正對奶牛面部，避免奶牛噴嚏飛沫濺到身上；操作期間禁止飲食、吸煙和接打電話。操作人員裸露部位意外接觸到疫苗或感染材料，用肥皂水清洗，工作結束可用0.1%新潔爾滅洗手和前臂，4DB13/Txxxx—2022或75%酒精擦拭。7.4.4制定不同崗位人員防護操作規(guī)程，加強職業(yè)健康教育、生物安全和防護知識培訓，提供必要的防護用品。7.5運輸工具與器具管理7.5.1一切車輛無必要不進場，本場職工用車停在場外，生產區(qū)內專用運輸工具禁止駛出本區(qū)。7.5.2各功能區(qū)和牛舍的器具、用具和運輸工具專用，禁止外借和交叉使用。7.6消毒管理7.6.1進入場區(qū)消毒。場區(qū)門口設置覆蓋全車的車輛消毒通道和人員消毒通道，進場車輛和人員分別經各自通道消毒后方可進入。7.6.2進入生產區(qū)消毒。生產區(qū)門口設置人員消毒通道、車輛消毒通道和物品消毒間，進入人員需經消毒、洗浴、更衣，進入車輛和物品需經消毒。7.6.3進入牛舍消毒。在舍門口洗手消毒，腳踏消毒池或消毒墊后方可進入。7.6.4設施設備消毒。牛舍、給水、給料、排污等固定設施設備定期清理、清掃、清洗、消毒；擠奶廳以及擠奶、配種、接產、診療等器具使用前后清洗消毒。7.6.5牛體消毒。擠奶、配種、接產、診療、注射、采樣、佩標等任何與奶牛接觸操作前，應對接觸部位及周圍進行擦拭消毒。7.6.6場所環(huán)境消毒。病死牛、流產物、胎衣及時清除，污染的場所嚴格消毒。場區(qū)及周圍保持清潔，定期進行環(huán)境消毒。7.6.7建立健全消毒制度。建立適合本場的消毒管理制度，配備必要的清洗消毒設備，制定關鍵環(huán)節(jié)和風險點消毒操作規(guī)程；選擇殺菌譜廣、消毒力強、對人和牛安全、無殘留毒性、對設施設備無腐蝕的消毒劑，現(xiàn)用現(xiàn)配，定期更換。禁止不同消毒劑混合使用，做好消毒記錄。7.7防疫管理7.7.1衛(wèi)生與獸醫(yī)防疫。符合GB16568、NY5047要求。7.7.2疫苗免疫。強制免疫病種符合國務院農業(yè)農村主管部門的相關規(guī)定；疫苗選擇符合NY5030相關規(guī)定；疫苗的運輸、貯存、使用符合NY/T1952相關規(guī)定；建立免疫檔案。實施布魯氏菌疫苗免疫前，應當向所在地縣級以上農業(yè)農村主管部門提出申請，逐級報至省級農業(yè)農村主管部門備案。7.7.3生物媒介控制。牛舍、料庫防鳥、滅鼠；昆蟲茲生季節(jié)殺滅蚊蠅。7.7.4無害化處理。病死牛、流產物、胎衣處理符合GB16548；糞污、墊料、醫(yī)療廢棄物等排放和無害化處理符合GB18596和GB7959規(guī)定。7.7.5動物疫情處置。按《動物防疫法》、《重大動物疫情應急條例》、單病種的應急預案、實施方案、防治技術規(guī)范等國家有關規(guī)定執(zhí)行。5DB13/Txxxx—2022附錄A（規(guī)范性附錄）布魯氏菌抗體瓊脂凝膠免疫擴散試驗光滑型布魯氏菌經三氯乙酸提取獲得2種抗原，一種是脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS另一種是稱為天然半抗原（NativeHapten，NH）的多聚糖。LPS抗原免疫原性強，自然菌和疫苗菌均可刺激機體產生LPS抗體。NH抗原免疫原性弱，自然菌感染尤其在活動期或排菌期持續(xù)強烈刺激機體產生NH抗體，而疫苗菌很難產生NH抗體?？乖c血清抗體均可在瓊脂凝膠上擴散，結合形成復合物時在瓊脂界面出現(xiàn)可見沉淀線。LPS抗原分子量大、擴散慢，沉淀線則靠近抗原端，NH抗原分子量小、擴散快，沉淀線則靠近被檢血清端。據此可以鑒別自然感染抗體和疫苗免疫抗體。A.2材料A.2.1儀器與耗材恒溫恒濕培養(yǎng)箱，10μL~100μL的移液器及吸頭。A.2.2試劑布魯氏菌病抗體瓊脂凝膠免疫擴散試劑盒，包含瓊脂平板、LPS和NH混合抗原、陽性對照血清和陰性對照血清。A.2.3被檢血清牛的新鮮血清。A.3操