TSDYYXH 01-2023 基于斑馬魚模型的藥物早期肝毒性快速評(píng)價(jià)方法

ICS11.120.01CCSC10SDYYXH團(tuán) 體 標(biāo) 準(zhǔn)T/SDYYXH01—2023基于斑馬魚模型的藥物早期肝毒性快速評(píng)價(jià)方法Arapidmethodforevaluatingearlyhepatotoxicityofdrugsusingzebrafishmodel2023-12-28發(fā)布 2023-12-28實(shí)施山東省醫(yī)藥行業(yè)協(xié)會(huì)??發(fā)布T/SDYYXH01T/SDYYXH01—2023II目 次前 言 2范圍 3規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 3方法原理 3受試物 4儀器設(shè)備 4試驗(yàn)準(zhǔn)備 4試驗(yàn)步驟 5保證試驗(yàn)有效性的條件 5判定標(biāo)準(zhǔn) 5數(shù)據(jù)處理 6試驗(yàn)報(bào)告 6附 錄 A （資料性）斑馬魚典型圖片 7T/SDYYXH01T/SDYYXH01—2023PAGEPAGE4前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由山東省醫(yī)藥行業(yè)協(xié)會(huì)提出并歸口。本文件主要起草單位：山東省科學(xué)院生物研究所。山東宏濟(jì)堂制藥集團(tuán)股份有限公司，山東沃華醫(yī)藥科技股份有限公司，濟(jì)寧華能制藥廠有限公司。主要起草人：孫晨，張?jiān)?，王天澤，劉凱，劉濤，范麗敏，孟兆青，劉可春，李振，王雪，夏青，周萬輝，何秋霞，梁會(huì)亮,靳夢(mèng)，程世娟，李曉彬基于斑馬魚模型的藥物早期肝毒性快速評(píng)價(jià)方法范圍本文件適用于基于斑馬魚模型的藥物早期肝毒性的快速評(píng)價(jià)。規(guī)范性引用文件GB/T39649實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與質(zhì)量控制GB/T21808化學(xué)品魚類延長(zhǎng)毒性14天試驗(yàn)GB5749生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。斑馬魚 zebrafish模式動(dòng)物的一種，常用于教學(xué)和科研。生物分類學(xué)上屬于脊索動(dòng)物門、脊椎動(dòng)物亞門、硬骨魚綱、鯉形目、鯉科、斑馬魚屬、斑馬魚種。Tg（L-FABP:EGFP）品系轉(zhuǎn)基因斑馬魚 Tg（L-FABP:EGFP）straintransgeniczebrafish實(shí)驗(yàn)室常用斑馬魚品系，肝臟被綠色熒光標(biāo)記。仔魚 larva性腺發(fā)育尚未成熟的斑馬魚。受精后小時(shí)數(shù) hourspost-fertilization（hpf）斑馬魚胚胎體外受精后的小時(shí)數(shù)。沒有心跳 lackofheartbeat一分鐘內(nèi)心臟沒有跳動(dòng)。1?死度 10 letalconentatin（L）受試物導(dǎo)致10%受試魚死亡的濃度。15秒內(nèi)沒有心跳判定為死亡。熒光顯微成像 fluorescencemicroscopy對(duì)特定樣本使用熒光蛋白或分子標(biāo)記后，對(duì)其標(biāo)記物成像的光學(xué)顯微成像技術(shù)。組織切片 tissueslice以生物組織為材料，處理為薄片，應(yīng)用于玻片以適合顯微鏡之觀察。熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) real-timequantitativePCR（RT-qPCR）在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，應(yīng)用熒光化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。方法原理hpf時(shí)，肝臟形態(tài)基本形成；受精72hpf后，肝臟的形態(tài)及功能全部發(fā)育成熟。斑馬魚的肝臟對(duì)藥物的介入非常敏感，肝毒性藥物極易使其生理結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞發(fā)生凋亡。綜上所述，以斑馬魚為試驗(yàn)動(dòng)物，應(yīng)用熒光顯微成像、組織切片和熒光實(shí)時(shí)定量PCR等技術(shù)，以肝臟面積、肝臟組織形態(tài)和凋亡相關(guān)基因表達(dá)等為檢測(cè)指標(biāo)，可對(duì)藥物的早期肝臟毒性進(jìn)行快速定量分析。受試物受試物配制水溶性藥物：斑馬魚培養(yǎng)水直接溶解配制成檢測(cè)溶液。非水溶性藥物：選用有機(jī)溶劑、乳化劑或分散劑等進(jìn)行助溶，制備成均勻分散的懸濁液或乳濁液。受試物準(zhǔn)備量10?mg～50?mg。30?mL～50?mL。受試物相關(guān)信息受試物的名稱、來源、性狀、批號(hào)、規(guī)格、生產(chǎn)日期、保存條件、有效期和配制方法。受試物為單體成分時(shí)，還需要提供該成分相應(yīng)的化學(xué)信息，包括分子量、分子式、分子結(jié)構(gòu)。提供受試物理化性質(zhì)，包含如下信息：在水中或其它溶劑中的溶解性；在水中和光中的穩(wěn)定性；溫度對(duì)受試物穩(wěn)定性的影響。儀器設(shè)備0.0001g。量筒。500mL0.5mL。40組織切片機(jī)。可用于石蠟組織切片的制備。RT-qPCR96PCR0.25～99.9℃。恒溫光照培養(yǎng)箱。精度±1℃。斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)。配備溫控裝置，水循環(huán)和過濾裝置。水質(zhì)監(jiān)測(cè)設(shè)備。pH試驗(yàn)容器。玻璃或聚苯乙烯容器。如受試物可能吸附于聚苯乙烯容器時(shí)，應(yīng)選用惰性材料（如玻璃）來減少吸附。試驗(yàn)準(zhǔn)備受試斑馬魚發(fā)育至72hpf肝臟顯示綠色熒光的健康Tg（L-FABP:EGFP）品系轉(zhuǎn)基因斑馬魚。斑馬魚的應(yīng)用符合GB/T39649相關(guān)規(guī)定。斑馬魚培養(yǎng)水24h（GB57495mmol/LNaCl、0.17mmo/LKC0.4mmo/LCaC2和0.16mmo/LMgS。14625gNal0.64gKC2.20gCal2和1.72gMgS7HO1000mL5020mL的50980mL1pH6.58.以CaC3計(jì)為10mg/～250mgL6.0mg/。注：此培養(yǎng)水為斑馬魚提供最適生存水環(huán)境。試驗(yàn)溶液配制pH6.5～8.0pHpH6.58.0GB/T218086.3.2pH非水溶性受試物，添加有機(jī)溶劑、乳化劑或分散劑提高受試物溶解度和試驗(yàn)溶液的均勻度。受100mg/L。試驗(yàn)步驟試驗(yàn)分組試驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組和受試物組，如使用助溶劑，增設(shè)1個(gè)溶劑對(duì)照組?？瞻讓?duì)照組設(shè)置隨機(jī)挑取肝臟顯示綠色熒光的健康615尾仔魚和5mL斑馬魚培養(yǎng)水。溶劑對(duì)照組設(shè)置隨機(jī)挑取肝臟顯示綠色熒光的健康615尾仔魚和5mL助溶劑溶液。助溶劑溶液濃度為受試物組使用助溶劑的最高濃度。陽性對(duì)照組設(shè)置Tg（L-FABP:EGFP）65mL6mM。受試物組設(shè)置Tg（L-FABP:EGFP）6155mL7.3LC15暴露條件28.51注：暴露期間禁止喂食。肝臟面積檢測(cè)暴露結(jié)束，熒光顯微鏡下觀察拍攝仔魚顯示綠色熒光的肝臟組織圖像（典型圖片見附錄A），并測(cè)量其面積。肝臟組織形態(tài)檢測(cè)暴露結(jié)束，4%多聚甲醛固定仔魚組織，應(yīng)用石蠟將其包埋后，將仔魚制備為厚度為5-10μm的石蠟（典型圖片見附錄A）。凋亡相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)RT-qPCR、的表達(dá)量。保證試驗(yàn)有效性的條件90水溶性受試物可配制成澄清溶液，非水溶性受試物可選用二甲基亞砜、乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑進(jìn)行助溶。斑馬魚圖像采集時(shí)，各組間拍照參數(shù)一致。判定標(biāo)準(zhǔn)試物組與空白對(duì)照組相比，斑馬魚凋亡相關(guān)基因和表達(dá)量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著增加數(shù)據(jù)處理毒性評(píng)價(jià)指標(biāo)：斑馬魚的肝臟面積，肝臟組織病理改變、凋亡相關(guān)基因、表達(dá)量。統(tǒng)計(jì)分析方法：方差分析（ANOVA）T-test試驗(yàn)報(bào)告試驗(yàn)報(bào)告包含下列內(nèi)容：受試物——物理屬性、物理/化學(xué)特性；受試斑馬魚——學(xué)名、品系、來源、發(fā)育階段、受精卵收集方法及后續(xù)處理；試驗(yàn)條件：光照周期；試驗(yàn)設(shè)計(jì)（試驗(yàn)容器及其平行的數(shù)目，每個(gè)平行中的仔魚數(shù)量）；制備儲(chǔ)備液的方法；若使用助溶劑，應(yīng)給出其成分和濃度；