紅花石蒜組培快繁技術(shù)規(guī)程

1紅花石蒜組培快繁技術(shù)規(guī)程本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了紅花石蒜（Lycorisradiata）外植體采集與處理、培養(yǎng)基配置、外植體接種、組織培養(yǎng)、煉苗移栽、移栽苗管理和記錄等技術(shù)要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于紅花石蒜組培苗的生產(chǎn)。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6001育苗技術(shù)規(guī)程LY/T1000容器育苗技術(shù)3外植體采集與處理3.1外植體采集3.1.1在3月~10月選擇晴天的天氣，采集表面無(wú)損的鱗莖作為外植體。3.1.2將紅花石蒜周?chē)s30cm的土壤挖開(kāi)，用手刨出鱗莖球，撥掉球莖所帶的泥土。采集完球莖后，覆土填平。3.2外植體處理3.3.1剪去紅花石蒜鱗莖球根部，剝?nèi)ネ鈱喻[莖片，帶鱗莖盤(pán)切成長(zhǎng)為2cm~3cm的鱗莖片，放入燒杯中用1%洗衣粉溶液浸泡5min，然后流水沖洗1h~2h，最后用蒸餾水沖洗，轉(zhuǎn)至超凈工作臺(tái)。3.3.2在超凈工作臺(tái)上，用配制好的75%乙醇浸泡30s，然后用無(wú)菌水沖洗2次~3次。3.3.3配制終濃度為1%的次氯酸鈉消毒液，用其浸泡材料30min后，用無(wú)菌水沖洗5次~6次，并用無(wú)菌濾紙吸干水分后備用。4培養(yǎng)基配制4.1MS培養(yǎng)基母液配制4.1.1制作培養(yǎng)基前需先配制培養(yǎng)基母液，MS培養(yǎng)基母液配制比例參見(jiàn)附錄A。4.1.2母液配制應(yīng)用蒸餾水。4.1.3配制大量元素母液時(shí)，每個(gè)組分單獨(dú)溶解，避免沉淀發(fā)生。24.1.4配制后的母液應(yīng)置于4℃冰箱中冷藏保存，微量元素母液用棕色瓶盛裝保存，母液配制后應(yīng)及時(shí)使用，貯存時(shí)間不宜超過(guò)3個(gè)月。4.1.5母液容器上應(yīng)貼好標(biāo)簽，注明名稱、配制日期，發(fā)現(xiàn)母液中有沉淀或絮狀物出現(xiàn)應(yīng)停止使用。4.2植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)母液配制植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)母液的配制濃度為0.5mg/mL，其配制方法參見(jiàn)附錄B。母液配制好后濾膜過(guò)濾除菌，濾液貼好標(biāo)簽并置于4℃冰箱中冷藏，保存期不超過(guò)3個(gè)月。4.3培養(yǎng)基選擇誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.2mg/L；增殖培養(yǎng)基：MS+6-BA5.0mg/L+2,4-D1.0mg/L+NAA0.5mg/L；生根培養(yǎng)基：MS+IBA1.0mg/L。4.4培養(yǎng)基制作4.4.1準(zhǔn)備好配制容器（1L燒杯、玻璃棒和量筒）、蒸餾水、瓊脂粉、蔗糖和各類母液等。4.4.2先用燒杯盛有少量蒸餾水，參考用量參見(jiàn)附表A。4.4.3按蔗糖濃度30g/L計(jì)算用量，稱量后用蒸餾水溶解，然后用容量瓶定容。4.4.4根據(jù)培養(yǎng)基的選擇加入植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，玻璃棒攪拌均勻。用pH計(jì)測(cè)試酸堿度，調(diào)節(jié)pH值至5.6~5.8。4.4.5將稱量好的瓊脂粉（6g/L~7g/L）加入燒杯中加熱攪拌至完全溶解。4.4.6分裝時(shí)，不應(yīng)將培養(yǎng)基傾倒在培養(yǎng)瓶瓶口。分裝后立即用瓶蓋蓋上，并旋緊。4.5培養(yǎng)基滅菌4.5.1將分裝好的盛有培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶放入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)。打開(kāi)冷凝閥，排盡滅菌鍋內(nèi)的冷空氣。當(dāng)氣壓達(dá)到0.1Mpa、溫度升至121℃時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，保持溫度并進(jìn)行壓力滅菌20min。4.5.2關(guān)閉滅菌鍋電源，以慢排方式排放熱氣。待滅菌鍋內(nèi)的氣壓表指針降至0時(shí)再打開(kāi)高壓滅菌鍋蓋，取出培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基平放置于接種室或培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行冷卻。4.6培養(yǎng)基保存滅菌后的培養(yǎng)基應(yīng)注明培養(yǎng)編號(hào)及配制日期，同時(shí)按培養(yǎng)基種類、配制先后順序分別儲(chǔ)存于接種室或培養(yǎng)室。儲(chǔ)存時(shí)間不宜超過(guò)2周。5外植體接種5.1接種環(huán)境接種前，接種室和超凈工作臺(tái)內(nèi)要進(jìn)行紫外線消毒20min~30min，操作人員關(guān)閉紫外燈并通風(fēng)15min后再進(jìn)行操作。操作時(shí)應(yīng)佩戴一次性乳膠手套，并在進(jìn)入超凈臺(tái)前用75%乙醇噴灑消毒。接種結(jié)束后，應(yīng)及時(shí)清理接種室和超凈工作臺(tái)及雜物。5.2接種35.2.1將接種工具（手術(shù)刀和鑷子）用牛皮紙包好，放入高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，按照4.5的方法，進(jìn)行高壓滅菌。將滅菌好的接種工具放入65℃烘箱中干燥24h，噴灑75%的乙醇表面消毒后立即轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)。每轉(zhuǎn)接完一個(gè)培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)材料，均應(yīng)將接種工具放在酒精燈外燃火焰上灼燒10s，同時(shí)更換接種器皿中的濾紙，以避免交叉污染。5.2.2在無(wú)菌的培養(yǎng)瓶中，將消毒處理后的鱗莖小塊接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每瓶接種1塊~2塊。接種完成后，用記號(hào)筆在培養(yǎng)瓶上標(biāo)注接種日期、編號(hào)或名稱。5.2.3每次接種完畢后，應(yīng)用75%的乙醇將超凈工作臺(tái)的臺(tái)面及兩邊擋板等擦拭干凈，同時(shí)將接種器皿及接種工具重新按照5.2.1的方法進(jìn)行滅菌消毒處理。6組織培養(yǎng)6.1培養(yǎng)條件培養(yǎng)室內(nèi)溫度為24±2℃,培養(yǎng)瓶上部的光照強(qiáng)度為100μmol-1m-2s-1~150μmol-1m-2s-1，光照時(shí)間為每6.2誘導(dǎo)培養(yǎng)將已消毒的鱗莖小塊接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，15d~20d后芽開(kāi)始萌發(fā)，25d左右莖尖變綠并伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，40d左右芽可長(zhǎng)高至2cm~3cm。6.3增殖培養(yǎng)將誘導(dǎo)培養(yǎng)形成的單個(gè)幼芽或叢生芽，接種到增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)周期約為30d。6.4生根培養(yǎng)將增殖培養(yǎng)后的叢生芽切割成單個(gè)完整的幼芽，并使其基部插入生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根培養(yǎng)2周~3周。7煉苗移栽7.1煉苗選取株高大于3cm，根長(zhǎng)1cm~4cm，且形成小鱗莖的組培苗放置溫室自然散射光下，打開(kāi)瓶蓋，加注少量無(wú)菌水（水深0.5cm左右）煉苗2d~3d，控制溫度在18℃~28℃,濕度控制在70%~80%。7.2移栽7.2.1移栽基質(zhì)泥炭土與珍珠巖比例為2:1，并加入0.5g/L的多菌靈攪拌均勻，然后裝入營(yíng)養(yǎng)缽中壓緊待用。7.2.2用鑷子將無(wú)菌苗從培養(yǎng)瓶中小心取出，注意保護(hù)根系，將根部粘附的瓊脂用30℃~35℃清水清洗干凈，移到營(yíng)養(yǎng)缽中，用基質(zhì)將根埋好。移栽后及時(shí)澆透水，外面用遮陽(yáng)網(wǎng)罩著，避免陽(yáng)光直射。48移栽苗管理和記錄8.1水分管理在遮蔭且通風(fēng)條件下培養(yǎng)2d~3d，向葉面噴水1次，2周后，撤掉遮蔭，但要注意通風(fēng)。此后，每隔2周~3周澆水1次。8.2大田移栽時(shí)間移栽苗移栽完成2個(gè)月以上于當(dāng)年秋季或翌年春季移栽至大田。8.3記錄應(yīng)建立完整、真實(shí)的組培栽培管理記錄檔案，檔案保存2年以上。