DB21-T 3005-2018牛冷凍精液質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.30

B43

備案號(hào)：61299-2019DB21

遼寧省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB21/T3005—2018

牛冷凍精液質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

Technicalspecificationonqualitytestsforbovinefrozensemen

DB21/T3005—2018

牛冷凍精液質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)規(guī)程

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了牛冷凍精液質(zhì)量檢測(cè)的冷凍精液劑量、精子活力、前向運(yùn)動(dòng)精子數(shù)、精子畸型率、細(xì)

菌數(shù)等檢測(cè)技術(shù)內(nèi)容。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于牛冷凍精液的質(zhì)量檢測(cè)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文

件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB4143-2008牛冷凍精液

NY/T1234-2006牛冷凍精液生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

3劑量檢測(cè)

3.1主要器材

5.0mL小試管、試管架、細(xì)管剪、1.0mL刻度吸管、撿卵器、細(xì)管精液專用推針。

3.2檢測(cè)方法

隨機(jī)抽取3支細(xì)管凍精自然解凍后剪去超聲波封口端，用細(xì)管精液專用推針把精液逐一推入1個(gè)

5.0mL小試管內(nèi)。用乳膠管將1.0mL刻度吸管與撿卵器聯(lián)接緊密后，吸盡5.0mL小試管內(nèi)的精液，并準(zhǔn)確

讀取其精液量。

3.3計(jì)算

3支細(xì)管凍精精液量的平均值為該樣品的劑量值。及時(shí)記錄檢測(cè)結(jié)果，牛冷凍精液劑量記錄表參照

附表A.1。

N

Q

3.........................................(1)

式中：

Q——?jiǎng)┝恐?，單位為mL；

N——3支樣品精液量，單位為mL。

4精子活力檢測(cè)

4.1主要器材

1

DB21/T3005—2018

相差顯微鏡或相差顯微攝像系統(tǒng)、恒溫載物臺(tái)、玻片加熱臺(tái)、恒溫水浴箱、5.0mL小試管、試管架、

載玻片（76mm×25.4mm）或精液性狀板、蓋玻片、細(xì)管剪、10μL移液器、移液器槍頭、吸水紙。

4.2檢測(cè)方法

取3支細(xì)管凍精置于37℃水浴中解凍，取出細(xì)管用吸水紙擦干，用細(xì)管剪剪去超聲波封口端，用細(xì)

管精液專用推針把精液逐一推入5.0mL試管內(nèi)，輕輕搖晃混勻。用移液器取精液5μL置于載玻片的一端，

另取5μL置于載玻片的另一端，蓋上經(jīng)在恒溫載物臺(tái)上預(yù)熱至38℃的蓋玻片，制成2個(gè)樣片后，立即置于

38℃載物臺(tái)上，在100倍或200倍相差顯微鏡下觀察活力，也可通過相差顯微系統(tǒng)在顯示屏上觀察活力。

每個(gè)樣片觀察3個(gè)視野，分別得出2個(gè)樣片活力。

4.3計(jì)算

2個(gè)樣片活力的平均值為該樣品的活力值。及時(shí)記錄檢測(cè)結(jié)果，牛冷凍精液精子活力檢測(cè)記錄表參

照附表A.2。

nn

n(%)12....................................(2)

2

式中：

n——活力，%；

n1——第1樣片活力，%；

n2——第2樣片活力，%。

5前向運(yùn)動(dòng)精子數(shù)檢測(cè)

5.1主要器材

血球計(jì)數(shù)板、一次性ZJ-1型20μL定量采血管、1.0mL刻度吸管、5.0mL小試管、撿卵器、血蓋片、計(jì)

數(shù)器、顯微鏡或顯微攝像系統(tǒng)、移液器（20μL、1mL）、3.0%氯化鈉溶液。

5.2檢測(cè)方法

5.2.1用1.0mL刻度細(xì)管取0.99mL的3.0%氯化鈉溶液注入5.0mL小試管內(nèi)，將定量采血管與撿卵器

聯(lián)接緊密，準(zhǔn)確吸取10μL精液（可用劑量檢測(cè)后的樣品），注入5.0mL小試管內(nèi)混勻，使之成為100

倍稀釋的稀釋精液。

5.2.2用血蓋片將血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)室蓋好，用移液器吸取8μL稀釋精液于血蓋片邊緣，使之自行流入

一個(gè)計(jì)數(shù)室，均勻充滿，避免有氣泡或厚度過大，再用同樣方法均勻充滿另一個(gè)計(jì)數(shù)室。

5.2.3計(jì)數(shù)板靜置5min（也可放入墊有濕紙的平皿中，以免水分蒸發(fā)），先在低倍鏡下找到計(jì)數(shù)室，

然后轉(zhuǎn)換到高倍鏡，在顯微鏡下或電視顯示屏上觀察計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)方法見附錄B。

5.3計(jì)算

（a）每劑量中精子數(shù)（S）=5個(gè)中方格中的精子數(shù)×5（即計(jì)數(shù)室25個(gè)中方格的總精子數(shù)）×10（1cm3

內(nèi)的精子數(shù)）×1000（每mL稀釋精液的精子數(shù)）×100（細(xì)管精液稀釋倍數(shù)）×劑量值

上式可簡(jiǎn)化為：

每劑量中精子數(shù)（S）=5個(gè)中方格精子數(shù)×500萬×劑量值

2

DB21/T3005—2018

（b）每樣品觀察上下2個(gè)計(jì)數(shù)室，取平均值，如果2個(gè)計(jì)數(shù)室計(jì)數(shù)結(jié)果誤差超過5%，則應(yīng)重檢。

（c）每劑量中呈前向運(yùn)動(dòng)精子數(shù)按下式計(jì)算。及時(shí)記錄檢測(cè)結(jié)果，每劑量中前向運(yùn)動(dòng)精子數(shù)檢測(cè)

記錄表參照附表A.3。

CSM......................................(3)

式中：

C——每劑量中前向運(yùn)動(dòng)精子數(shù)，單位為個(gè)；

S——每劑量中精子數(shù)，單位為個(gè)；

M——精子活力，%。

6精子畸形率檢測(cè)

6.1主要器材

電子天平、相差顯微鏡、磨砂載玻片（規(guī)格76.2mm×25.4mm、厚度1mm）、凹玻片、血球分類計(jì)數(shù)

器、玻片架、小吸管、10μL移液器、蒸餾水、染色板、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、甲醛、碳酸鎂、氯

化鈉溶液（0.89%）、量筒、試劑瓶（棕色）、三角漏斗、濾紙、記號(hào)筆、吹風(fēng)機(jī)等，所用試劑應(yīng)為AR

級(jí)以上。

6.2中性福爾馬林固定液的配制

6.2.1在40%甲醛（HCHO）中加入碳酸鎂，飽和后用三角漏斗、濾紙過濾。

6.2.2用電子天平稱量磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）0.55g、磷酸氫二鈉（Na2HPO4.12H2O）2.25g，用

濃度為0.89%氯化鈉溶液50mL進(jìn)行溶解，完全溶解后加入8mL飽和的甲醛，再加濃度為0.89%氯化鈉溶

液定溶至100mL，倒入試劑瓶中備用。

6.3制片、鏡檢

6.3.1抹片

用10μL移液器取精液一小滴，滴于載玻片一端，用另一邊緣光滑的凹玻片與有樣品的載玻片呈35°

夾角，將樣品均勻地拖布于載玻片上，自然風(fēng)干，每個(gè)樣品制作2個(gè)抹片。抹片制作完成后用記號(hào)筆作

好標(biāo)記（品種、牛號(hào)）。

6.3.2固定

可采用在已風(fēng)干的抹片上滴1～2mL中性福爾馬林固定液的固定方式，也可采用將風(fēng)干后的抹片反扣

在染色板上，把固定液滴于槽和抹片之間，讓其充滿平槽并使抹片接觸固定液進(jìn)行固定的方式。固定

15min后用清水緩緩沖去固定液，用吹風(fēng)機(jī)吹干或自然風(fēng)干。

6.3.3鏡檢

將制備好的抹片在200倍顯微鏡下觀察，每個(gè)抹片觀察200個(gè)以上的精子（分左、右兩個(gè)區(qū)），取2

片的平均值，2片的變異系數(shù)若大于20%應(yīng)重新制片。

6.4計(jì)算

精子畸形率按下式計(jì)算。及時(shí)記錄檢測(cè)結(jié)果，精子畸形率記錄表參照附表A.4。

3

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A

A(%)1100....................................(4)

S

式中：

A——精子畸形率，%；

A1——畸形精子數(shù)，單位為個(gè)；

S——所查精子總數(shù)，單位為個(gè)。

7細(xì)菌數(shù)檢測(cè)

7.1主要器材

電熱恒溫培養(yǎng)箱、超凈化工作臺(tái)、電冰箱、電熱恒溫水浴鍋、電子天平、萬用電爐、石棉網(wǎng)、三角

燒瓶（容量為250mL）、平皿（直徑為90mm）、酒精燈、菌落計(jì)數(shù)器、細(xì)管剪、細(xì)管專用推針、棉繩、

脫脂棉、牛皮紙、透氣硅膠塞、量筒、稱量紙、角匙、記號(hào)筆、電熱壓力蒸汽消毒器、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、

75%乙醇。

7.2檢測(cè)方法

7.2.1營(yíng)養(yǎng)瓊脂的制備

根據(jù)檢測(cè)實(shí)際需要量，按所購(gòu)買的營(yíng)養(yǎng)瓊脂粉使用說明配制適量的營(yíng)養(yǎng)瓊脂，加熱煮沸至完全溶解，

經(jīng)電熱壓力蒸汽消毒器121℃、15min滅菌后備用。

7.2.2凍精解凍

將樣品從液氮中取出，迅速放入37℃水浴中解凍待用。每一樣品解凍2支。

7.2.3將精液注入平皿

在超凈工作臺(tái)內(nèi)，點(diǎn)燃酒精燈，平皿蓋盒面上用記號(hào)筆標(biāo)記上牛號(hào)，用酒精棉球擦拭整支細(xì)管，將

細(xì)管剪在酒精燈上來回烘烤幾下后，剪去細(xì)管的超聲波封口端，用專用推針將整支細(xì)管的精液注入滅菌

平皿內(nèi)。

7.2.4平皿內(nèi)加入營(yíng)養(yǎng)瓊脂

精液注入平皿后，應(yīng)及時(shí)將50℃±1℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒入平皿，每個(gè)平皿10～15mL，并轉(zhuǎn)動(dòng)平

皿使其混合均勻（方法：左3圈、右3圈、前后1個(gè)來回）。同時(shí)將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基注入滅菌平皿內(nèi)作一

空白對(duì)照。待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h±2h。

7.2.5菌落計(jì)數(shù)方法

做平皿菌落計(jì)數(shù)時(shí)，可在光線較強(qiáng)處用肉眼觀察計(jì)數(shù)，也可以使用菌落計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。

7.2.6平皿菌落數(shù)的選擇

7.2.6.11個(gè)樣品使用2個(gè)平皿，應(yīng)采用2個(gè)平皿的平均數(shù)。若其中1個(gè)平皿有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，

則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長(zhǎng)的平皿作為該樣品的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平皿的一半，而其余

一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平皿后乘以2以代表全平皿菌落數(shù)。平皿內(nèi)如有鏈狀菌落生長(zhǎng)

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DB21/T3005—2018

時(shí)（菌落之間無明顯界限），若僅有1條鏈，可視為1個(gè)菌落，如果存在不同來源的幾條鏈，則應(yīng)將每

條鏈作為1個(gè)菌落計(jì)。

7.2.6.2當(dāng)計(jì)數(shù)平皿內(nèi)的菌落數(shù)超過300個(gè)且分布很均勻，可取平皿的1/2或1/4計(jì)數(shù)，再乘以相應(yīng)

的2或4作為該平皿的菌落數(shù)。

7.2.6.3到達(dá)規(guī)定培養(yǎng)時(shí)間應(yīng)立即計(jì)數(shù)，如果不能立即計(jì)數(shù)，應(yīng)將平皿放置于2℃～4℃的冰箱內(nèi)，但

不得超過24h。

7.3計(jì)算

1個(gè)樣品的2個(gè)平皿內(nèi)菌落平均數(shù)減空白對(duì)照平皿中的菌落數(shù)就是該份樣品每支細(xì)管凍精內(nèi)的細(xì)菌

數(shù)。及時(shí)記錄檢測(cè)結(jié)果，細(xì)菌數(shù)記錄表參照附表A.5。

nn

B12n

20

…………(5)

式中：

B——細(xì)菌數(shù)，單位為個(gè)；

n0——空白對(duì)照平皿菌落數(shù)，單位為個(gè)；

n1——第1個(gè)平皿菌落數(shù)，單位為個(gè)；

n2——第2個(gè)平皿菌落數(shù)，單位為個(gè)。

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AA

附錄A

（資料性附錄）

牛冷凍精液檢測(cè)原始記錄表（樣表）

表A.1牛精液劑量記錄表

室溫（℃）：相對(duì)濕度（%）：檢測(cè)日期：

序號(hào)品種牛號(hào)外觀劑型檢測(cè)值（mL）劑量值（mL）備注

檢測(cè)人：復(fù)核人：審核人：

表A.2精子活力檢測(cè)記錄表

室溫（℃）：相對(duì)濕度（%）：檢測(cè)日期：

第一樣片活力第二樣片活力平均活力

序號(hào)品種牛號(hào)備注

（%）（%）（%）

檢測(cè)人：復(fù)核人：審核人：

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表A.3前向運(yùn)動(dòng)精子數(shù)檢測(cè)表

室溫（℃）：相對(duì)濕度（%）：檢測(cè)日期：

第一計(jì)數(shù)室5個(gè)中方格中的第二計(jì)數(shù)室5個(gè)中方格中的每劑量前向運(yùn)

序品精子數(shù)（個(gè)）精子數(shù)（個(gè)）平均精子總動(dòng)精子備

牛號(hào)

號(hào)種小小值數(shù)（萬數(shù)（萬注

1234512345

計(jì)計(jì)個(gè)）個(gè)）

檢測(cè)人：復(fù)核人：審核人：

表A.4精子畸形率檢測(cè)表

室溫（℃）：相對(duì)濕度（%）：檢測(cè)日期：

第一抹片第二抹片

序品平均精子畸備

牛號(hào)精子畸形精子畸形精子畸形精子畸形

號(hào)種形率（%）注

總數(shù)精子數(shù)率（%）總數(shù)精子數(shù)率（%）

檢測(cè)人：復(fù)核人：審核人：

表A.5細(xì)菌數(shù)檢測(cè)表

CB室溫（℃）：）：相對(duì)濕度（%）：檢測(cè)日期：

室溫（℃）：相對(duì)濕度（%）：培養(yǎng)時(shí)間（h）：檢測(cè)日期：

第一平皿菌第二平皿菌平均菌落對(duì)照平皿菌細(xì)菌數(shù)

序號(hào)品種牛號(hào)備注

落數(shù)（個(gè)）落數(shù)（個(gè)）數(shù)（個(gè)）落數(shù)（個(gè)）（個(gè)）