實驗動物設(shè)計

實驗動物學(xué)設(shè)計大綱實驗名稱：課題來源：設(shè)計班級：設(shè)計人員：設(shè)計日期：指導(dǎo)老師：一、實驗設(shè)計的目的意義：實驗設(shè)計的目的意義，國內(nèi)外研究現(xiàn)狀，存在的問題，解決問題的思路。目的與意義:比較研究BALB/c小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒(RSV)感染模型的特點,建立理想動物模型,為研究發(fā)病機理和防治措施奠定基礎(chǔ)。國內(nèi)外研究現(xiàn)狀：人呼吸道合胞病毒(humanrespiratorysyncytialvirus,RSV)是全球嬰幼兒下呼吸道感染首位病毒病原體,幾乎所有兒童兩歲前感染過至少一次RSV[1],年齡越小病情越重,再感染率高,與哮喘發(fā)生密切相關(guān)[2]。免疫缺陷者更易感染,臨床癥狀更為嚴(yán)重,常致死亡[3]。每年住院治療的50%-75%嬰幼兒毛細支氣管炎和25%~40%的肺炎是RSV直接引起,1歲內(nèi)嬰兒RSV感染率68.8%,1-2歲感染率達82.6%~100%。嬰兒期急性RSV下呼吸道感染使非特應(yīng)體質(zhì)和特應(yīng)體質(zhì)兒童發(fā)生哮喘危險性都比普通兒童明顯增加,是哮喘的獨立危險因素[4]雖然已有許多抗RSV制劑和疫苗的研究,但尚無安全有效的防治方法?？筊SV制劑的研究需要建立理想的動物模型,但目前已建立的系列感染模型均不夠滿意。肺組織RSV抗原保護性免疫僅能維持數(shù)月,福爾馬林滅活疫苗不能起到保護作用反而加重病情,至今RSV仍無安全有效的治療藥物和預(yù)防疫苗,脫氧核酶等新型抗RSV制劑正在研究中,已在體外無細胞體系和細胞模型中表現(xiàn)抗病毒活性,需要建立恰當(dāng)?shù)膭游锬Ｐ?進一步在體內(nèi)研究其抗病毒作用[5]。從RSV發(fā)現(xiàn)至今,已建立的黑猩猩、獼猴、雪貂、牛、棉鼠、豚鼠和小鼠等感染模型各有優(yōu)勢和局限[6],除靈長類動物可出現(xiàn)臨床癥狀,其他都是無癥狀隱性感染[7]。BALB/c小鼠為近交繁殖產(chǎn)生，其對多種病原體具有易感性，利用小鼠建立模型的優(yōu)點是它易獲得,遺傳背景清楚而均一,基因改造技術(shù)成熟,已有多種商品化試劑,是目前應(yīng)用最廣泛的實驗動物。但小鼠不是RSV自然宿主,我們以往實驗發(fā)現(xiàn)BALB/c鼠感染RSV沒有臨床癥狀,肺內(nèi)病毒復(fù)制水平相對低,病毒滴度下降快,帶毒時間短,限制了治療效果的觀察[8]。裸小鼠采用nu／+雌鼠與nu／nu雄鼠交配方法產(chǎn)生，這種無毛小鼠是由于第11號染色體等位基因突變引起的，裸小鼠主要特征是無毛、裸體和無胸腺，缺乏成熟T細胞的免疫功能，B淋巴細胞正常，成年裸小鼠較普通小鼠有較高水平的NK細胞活性，目前未做過裸小鼠RSV感染模型，對其優(yōu)勢和局限尚不完全清楚。存在的問題：目前雖然已有許多抗RSV制劑和疫苗的研究,但尚無安全有效的防治方法，RSV感染具體發(fā)病機制也不夠清楚，其發(fā)病機制和抗RSV制劑的研究需要建立理想的動物模型,但目前已建立的系列感染模型均不夠滿意。解決問題的思路：復(fù)制BALB/c鼠和裸鼠RSV感染模型，不同時間空斑形成實驗檢測肺組織病毒滴度,計數(shù)支氣管肺泡灌洗液白細胞總數(shù)和分類情況,免疫熒光和免疫組化檢測RSV抗原,光鏡和電鏡檢查肺組織病理學(xué)改變，比較研究BALB/c小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒(RSV)感染模型的特點。參考文獻：[1]BlackCP.SystematicReviewoftheBiologyandMedicalManagementofRespiratorySyncytialVirusInfection[J].RespiratoryCare,2003;48(3):209-233.[2]HoltPC,S1yPD.InteractionsbetweenRSVinfection,asthmaandatopy:unravelingthecomplexities[J].JExpMed,2002;196(10):1271-1275.[3]MeissnerHC,RennelsMB,PickeringLK,etal.Riskofsevererespiratorysyncytialvirusdisease,identificationofhighriskinfantsandrecommendationsforprophylaxiswithpalivizumab[J].PediatrInfectDisJ,2004;23(3):284-285.[4]OddywH,deMerkNH,S1yPD,eta1.Theeffectsofrespiratoryinfections,atopyandbreastfeedingonchildhoodasthma[J].EurRespirJ,2002;19(5):899-905.[5]ZhaoC-A,ZhaoX-D,YuH-Getal.InhibitionofrespiratorysyncytialvirusreplicationinculturedcellsbyRNAcleavingDNAzyme[J].ChinJPediatr,2003;41(8):594-598.[6]SchmidtAC,JohnsonTR,PeterJM,etal.Respiratorysyncytialvirusandotherpneumoviruses:areviewoftheinternationalsymposium-RSV2003[J].VirusResearch,2004;106:1-13.[7]McArthur-VaughanK,GershwinLJ.Arhesusmonkeymodelofrespiratorysyncytialvirusinfection[J].JMedPrimatol,2002;31(2):61-73.[8]LianG-L,YuH-G,ZhaoX-D,etal.Establishmentofrespiratorysyncytialvirusinfectionmodelinmice[J].JXi’anJiaotongUniversity(MedicalSciences),2003;24(4):329-332.二、實驗設(shè)計方案（實驗設(shè)計目標(biāo),擬解決的主要問題,實驗動物設(shè)計,實驗專業(yè)設(shè)計，實驗統(tǒng)計設(shè)計,實驗方法設(shè)計，可行性分析,預(yù)期結(jié)果，實驗設(shè)計工作時間安排）。（一）實驗設(shè)計目標(biāo)，擬解決的關(guān)鍵問題設(shè)計目標(biāo)：比較研究BALB/c小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒(RSV)感染模型的特點,以建立理想動物模型擬解決的關(guān)鍵問題：BALB/c小鼠和裸小鼠呼吸道合胞病毒(RSV)感染模型的復(fù)制，對試驗性RSV感染的模型進行分組與實驗結(jié)果分析。（二）實驗設(shè)計1、實驗動物設(shè)計（遺傳背景，微生物質(zhì)量控制，育種繁殖，飼養(yǎng)管理，動物模型，實驗動物學(xué)技術(shù)）（1）遺傳背景BALB/c鼠遺傳背景：近交系BALB/c小鼠裸小鼠遺傳背景：采用nu／+雌鼠與nu／nu雄鼠交配方法產(chǎn)生的同源導(dǎo)入近交系小鼠（2）微生物質(zhì)量控制BALB/c小鼠微生物質(zhì)量要求：普通級動物要求。裸小鼠微生物質(zhì)量要求：SPF（無特定病原體）或無菌要求（3）飼養(yǎng)管理BALB/c小鼠飼養(yǎng)管理:BALB/c小鼠環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)：實驗動物飼養(yǎng)室的溫度為18-19℃，相對濕度為40%-70%，每小時換氣次數(shù)為10-20次，噪聲在60分貝以下，每立方米空氣中氨濃度在14mg以下，工作照度為150-300BALB/c小鼠設(shè)施：開放系統(tǒng)BALB/c小鼠籠器具：采用無毒塑料籠具，墊料選用具良好吸濕性、無毒性、無異味、塵埃少的材料如電刨花，墊料須經(jīng)高壓蒸汽滅菌BALB/c小鼠飼喂：飼喂小鼠全價營養(yǎng)顆粒飼料，飼料的消毒滅菌應(yīng)達到相應(yīng)等級小鼠微生物控制的要求。飼喂采取“少量勤添”的原則，每周喂料3-4次，飲水應(yīng)保證連續(xù)不斷，每周換水2-3次，墊料每周更換1-2次BALB/c小鼠飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生消毒：做好室內(nèi)的清潔、消毒、及飼料籠器具的清洗消毒，每次飼養(yǎng)完后，用苯扎溴銨擦拭籠架、地板，每月定期徹底噴霧消毒1次裸小鼠飼養(yǎng)管理:裸小鼠環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)：實驗動物飼養(yǎng)室的溫度為18-19℃，相對濕度為40%-70%，每小時換氣次數(shù)為10-20次，噪聲在60分貝以下，每立方米空氣中氨濃度在14mg以下，工作照度為150-300lx，空氣潔凈度為10裸小鼠設(shè)施：屏障系統(tǒng)或隔離系統(tǒng)裸小鼠籠器具：采用無毒塑料籠具，墊料選用具良好吸濕性、無毒性、無異味、塵埃少的材料如電刨花，一般所有的籠具、墊料、飼料、飲水等都得經(jīng)過滅菌消毒裸小鼠飼喂：每周飼喂全價營養(yǎng)飼料2—3次。飼料、飲水、墊料及鼠籠均用雙層包布包裝高壓蒸汽滅菌消毒。進室前經(jīng)緩沖室紫外燈照射后去除外層包布，才能進入繁殖室及實驗室裸小鼠飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生消毒：繁殖室設(shè)在空氣過濾十萬級環(huán)境中放置層流柜作為裸小鼠繁殖飼養(yǎng)條件。啟用前，先用2％新潔而滅全面擦拭，然后按消毒區(qū)域的容積用高錳酸鉀15g，In2加福爾馬林15mL混和熏蒸。最后經(jīng)紫外燈照射，細菌培養(yǎng)陰性才使用。啟用后我們的常規(guī)消毒是：進實驗室前后紫外燈照射30rain，每2周用2％新潔而滅擦拭墻壁、天花板，每一個月用過氧乙酸噴射消毒。每三個月用甲醛和高錳酸甲熏蒸一次(用備用實驗室輪流消毒和使用)。每三個月將層流柜的過濾材料拆下進行清洗。每年更換一次過濾材料。飼養(yǎng)人員定期入繁殖室進行飼養(yǎng)管理操作。進室前需淋浴并用新潔而滅常規(guī)泡手、消毒、穿無菌衣、帶襪的無菌褲、戴口罩、帽子。外層穿上手術(shù)隔離衣，并帶手術(shù)膠手套及無菌紗手套。每次操作完畢，用新潔而滅抹臺面及地面。常規(guī)每周換兩次籠具，投放34d的飼料與飲水。每周加兩次雞蛋和瓜子及一次維生素。2、實驗專業(yè)設(shè)計選用BALB/c鼠和裸小鼠作為實驗動物，感染RSV后不同時間空斑形成實驗檢測肺組織病毒滴度,計數(shù)支氣管肺泡灌洗液白細胞總數(shù)和分類情況,免疫熒光和免疫組化檢測RSV抗原,光鏡和電鏡檢查肺組織病理學(xué)改變3、實驗統(tǒng)計設(shè)計結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩兩組間比較用t檢驗,各組間比較用方差分析。α=0.05,P<0.05認為有顯著性差異。4、實驗方法設(shè)計實驗技術(shù)路線BALB/cBALB/c小鼠C：感染6天的C：感染6天的BALB/c小鼠B：感染3天的BALB/c小鼠A：對照BALB/c小鼠D：對照裸鼠裸小鼠F：感染6天的裸鼠E裸小鼠F：感染6天的裸鼠E：感染3天的裸鼠不同時間空斑形成實驗檢測肺組織病毒滴度不同時間空斑形成實驗檢測肺組織病毒滴度,計數(shù)支氣管肺泡灌洗液白細胞總數(shù)和分類情況,免疫熒光和免疫組化檢測RSV抗原,光鏡和電鏡檢查肺組織病理學(xué)改變實驗技術(shù)方法（1）隨機抽樣：選正常成年健康體重相近的BALB/c小鼠30只和裸小鼠30只，分別將30只BALB/c小鼠和30只裸小鼠按體重由小變大編號后，從隨機數(shù)字表中查取隨機數(shù)字，依次抄錄于小鼠編號下。具體方法：兩種動物編號為1—30號，30只BALB/c小鼠按照能被3除的規(guī)律：不余到A組，余1到B組，余2到C組；30只裸小鼠BALB/c小鼠按照能被3除的規(guī)律：不余到D組，余1到E組，余2到F組（2）實驗分組：實驗分六組：A：對照BALB/c小鼠B：感染3天的BALB/c小鼠C：感染6天的BALB/c小鼠D：對照裸鼠E：感染3天的裸鼠F：感染6天的裸鼠（3）模型復(fù)制:1.病毒和細胞培養(yǎng):Hep-2細胞接種RSV標(biāo)準(zhǔn)A2株病毒,含2%胎牛血清(FBS)DMEM培養(yǎng)至病變達90%~100%,吸取培養(yǎng)液,4℃,3000g離心10min收集上清,-802.病毒接種:BALB/c小鼠和無特殊病原菌(specificpathogenfree,SPF)級8～12周齡、雌性裸鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉0.06mg/g麻醉后,感染組鼻腔緩慢滴入2×106PFU/mlRSVA2株病毒液50μl,陰性對照組滴入50μl2%FBSDMEM。(4)取材:病毒分離和滴度分析:感染后不同時間處死小鼠,無菌條件下取左肺、肝臟和脾臟稱重,按10ml/g(wt/vol)加入預(yù)冷組織平衡液,勻漿制備肺臟、肝臟和脾臟組織懸液,4℃,2500g離心10min,取上清接種于Hep2細胞,2%FBS1640培養(yǎng)基,37℃,5%CO2培養(yǎng)(5)相關(guān)指標(biāo)測定:1.空斑形成實驗測定病毒滴度:3×105/mlVero細胞接種至6孔板,10%FBS的1640培養(yǎng)至單層致密無孔細胞,接種10倍倍比稀釋的病毒液100μl,每個濃度設(shè)復(fù)孔,未感染病毒為對照孔。病毒吸附2h后覆蓋含1.5%的瓊脂糖凝膠和2%FBS的1640培養(yǎng)基,培養(yǎng)5天,5mg/mlMTT顯色,計數(shù)空斑,計算病毒滴度:PFU/ml=稀釋度××P=該濃度下各孔空斑數(shù);n=復(fù)孔數(shù);v=每孔接種病毒液體積(ml)2.支氣管肺泡灌洗液白細胞計數(shù):感染后第3天、6天和9天處死小鼠,氣管插管,預(yù)冷生理鹽水0.5ml灌洗2次,收集支氣管肺泡灌洗液(BALF),血球計數(shù)儀計數(shù)白細胞總數(shù)。4℃,1000g離心10min,取細胞沉渣涂片,Wright染色,顯微鏡下計數(shù)200個白細胞,3.直接免疫熒光實驗:取感染后第3天小鼠BALF離心細胞沉渣涂片,4℃丙酮固定干燥,按LightDiagnosticsRespiratorypanel1DFA免疫熒光試劑盒說明書(Chemicon,USA)鑒定RSV抗原,4.肺組織病理學(xué)檢查:感染后第3天、6天處死小鼠,取未經(jīng)支氣管肺泡灌洗的右肺組織,一部分4%多聚甲醛固定,常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色,光鏡觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)。另一部分立即2.5%戊二醛固定,送重慶醫(yī)科大學(xué)電鏡室包埋、制成超薄切片,透射電鏡檢查。5.免疫組織化學(xué)檢查:RSV抗原免疫組織化學(xué)染色SP染色試劑盒(北京中杉生物技術(shù)公司),一抗是針對RSV整個病毒抗原的山羊多克隆抗體(USBiological,USA)。4%多聚甲醛固定肺組織,常規(guī)切片,各步操作按試劑盒說明進行,DAB顯色后顯微鏡下觀察。同一標(biāo)本未滴加一抗的切片作陰性對照。圖像分析采用北航真彩色病理圖像分析系統(tǒng)