黃芩種子 ITS2 序列鑒定方法

1DB14/T1403—2017芩種子ITS2序列鑒定方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了黃芩種子ITS2序列鑒定的術(shù)語和定義、原理、試劑與材料、黃芩種子ITS2序列特征、種子扦樣、種子處理、種子DNA提取方法、擴(kuò)增與測序、序列拼接與結(jié)果判斷。本標(biāo)準(zhǔn)適用于黃芩種子ITS2序列鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T3543.2農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程扦樣3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1ITS2序列在黃芩的rDNA基因中，5.8SrDNA和28SrDNA基因間隔序列稱為內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(ITS2)。4原理由于不同植物物種的ITS2核苷酸序列有差異，而同一物種不同植株間ITS2核苷酸序列保守，因此可以采用PCR擴(kuò)增與測序技術(shù)對黃芩與非黃芩種子進(jìn)行判斷。5試劑與材料5.1瓊脂糖5.2抗壞血酸鈉5.3β-巰基乙醇5.4聚乙烯吡咯烷酮（PVP）5.510g/L溴化乙錠（EB）溶液稱取1.0g溴化乙錠（EB），溶解于100mL水中。EB有致癌作用，配制和使用時應(yīng)戴一次性手套操作并妥善處理廢液。2DB14/T1403—20175.610mol/L氫氧化鈉溶液稱取400.0g氫氧化鈉（NaOH），加800mL水溶解后，再加水定容到1000mL。5.71mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液（pH8.0）稱取121.1g三羥甲基氨基甲烷（Tris）溶解于800mL水中，用鹽酸（HCl）調(diào)pH至8.0，用水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃)條件下滅菌20min。5.8500mmol/L乙二銨四乙酸二鈉溶液（pH8.0）稱取186.1g，乙二銨四乙酸二鈉（EDTA-Na2加入700mL水中，加入適量氫氧化鈉溶液（5.6加熱溶解后，冷卻至室溫，再用氫氧化鈉溶液（5.6）調(diào)pH至8.0，用水定容到1000mL。在103.4kPa（121℃)條件下滅菌20min。5.95mol/L氯化鈉溶液稱取292.2g氯化鈉（NaCl加800條件下滅菌20min。5.102%CTAB提取液量取1mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液（5.7）100mL，5mol/L氯化鈉溶液（5.9）280mL，500mmol/L乙二銨四乙酸二鈉溶液（5.8）40mL和20gCTAB，溶解后，加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃)條件下滅菌20min。5.11TE緩沖液（pH8.0）分別量取10mL三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液（5.7）和2mL乙二銨四乙酸二鈉溶液（5.8），加水定容至1000mL。在103.4kPa（121℃)條件下滅菌20min。5.12酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）溶液按體積比為25:24:1配制酚：氯仿：異戊醇（25:24:1）5.1350×TAE緩沖液稱取242.2g三羥甲基氨基甲烷，加入300mL水加熱攪拌溶解后，加入100mL乙二銨四乙酸二鈉溶液（5.8），用冰乙酸調(diào)pH至8.0，然后加水定容到1000mL。使用時用水稀釋成1×TAE。5.14加樣緩沖液稱取250.0mg溴酚藍(lán)，加入10mL水，在室溫下溶解12h；稱取250.0mg二甲基苯腈藍(lán)，加10mL水溶解；稱取50.0g蔗糖，加30mL水溶解，混合三種溶液，加水定容至100mL，在4℃下保存?zhèn)溆谩?.15DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)清楚的區(qū)分50bp～1000bp的DNA片段。5.16dNTPs混合溶液將濃度為10mmol/L的dATP、dTTP、dGTP、dCTP四種脫氧核糖核苷酸等體積混合。3DB14/T1403—20175.17TaqDNA聚合酶（5U/μL）及PCR反應(yīng)緩沖液。5.18ITS2基因引物ITS2-F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′ITS2-R：5′–GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′5.19引物溶液用TE緩沖液（5.11）分別將上述引物稀釋到10μmol/L。除非另有說明，以上試劑僅使用分析純試劑和重蒸餾水。5.20PCR產(chǎn)物回收試劑盒6黃芩種子ITS2序列特征黃芩ITS2序列參照陳士林著《中國藥典中藥材DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列》。黃芩ITS2序列長228bp，不同產(chǎn)地黃芩有不多于四個變異位點，分別為88、111倍點T-C變異，171倍點A-G變異，210倍點C-A變異。主導(dǎo)單倍型序列特征如下：CGCATCGCGTCGCCCCCCCTCGCACCACCTCGAGCGGTGCCATGTGGGGGGGGCGGAGATTGGCCCCCCGTGCGCCCCGGCGCGCGGCCGGCCCAAATGCGATCCCCCGGCGACGCACGCCCCGACAAGTGGTGGTTGTTTCCTCAACTCGCGTGCTGTCGTGTGCCAAGGCGTCGTCCGTTCAGGAGAGAATCGAAAGATGAGACCCAACGGCCATCGTGCCATCGA7種子扦樣按照GB/T3543.2的要求進(jìn)行。8種子處理黃芩種子表面經(jīng)無水乙醇處理后，用中藥材粉碎機(jī)或研磨儀粉碎，粉碎后顆粒直徑小于1mm，取100mg粉末置于2mL離心管中備用。9種子DNA提取方法種子DNA提取方法如下：a)在有100mg粉末的離心管中加入1000μL65℃預(yù)熱的2%CTAB提取液（5.10加入1μLβ-巰基乙醇，另加入少許PVP干粉，金屬浴65℃保溫30min，其間顛倒混勻3次。14000r/min離心10min。b)取上清液轉(zhuǎn)入另一個1.5mL的離心管，加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1），緩慢翻轉(zhuǎn)混勻，在14000r/min離心10min。c)重復(fù)上述步驟一次。d)取上清液，加入2/3體積的－20℃預(yù)冷的異丙醇，置于－20℃30min。在4℃條件下14000r/min離心10min。4DB14/T1403—2017e)棄上清，加入300Ml75%乙醇輕振蕩，在4℃條件下12000r/min離心10min。棄上清，室溫下靜置并自然風(fēng)干10min。f)將此沉淀加入100mL的無菌雙蒸水或TE緩沖液，4℃保存?zhèn)溆没蚍湃耄?0℃保存。10擴(kuò)增與測序10.1PCR擴(kuò)增10.1.1PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系見表1。表1PCR反應(yīng)體系注：10×PCR緩沖液含氯化鎂，以上反應(yīng)試劑按順序添加.10.1.2PCR反應(yīng)程序ITS2序列擴(kuò)增程序：94℃,變性5min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，40個循環(huán)；72℃延伸10min。不同型號的PCR儀，可將PCR反應(yīng)的退火和延伸時間適當(dāng)調(diào)整。10.1.3對照PCR反應(yīng)以黃芩種子DNA樣品為陽性對照，以無菌水作為空白對照反應(yīng)體系的模板。10.2PCR產(chǎn)物電泳10.2.1利用20g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，EB染色。10.2.2凝膠成像分析與測序利用凝膠成像儀分析，目的產(chǎn)物條帶單一，可直接送PCR產(chǎn)物測序；有多條帶或出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，需切膠回收再測序。測序由有資質(zhì)的測序服務(wù)公司進(jìn)行DNA測序。11序列拼接11.1序列方向序列方向應(yīng)與PCR擴(kuò)增正向引物方向一致。5DB14/T1403—201711.2序