《實驗猴寄生蟲病防治技術(shù)規(guī)范》（征求意見稿）

ICS11.220CCSB4145在提交反饋意見時，請將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。IDB45/TXXXX—XXXX II 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14診斷方法 25防治要求 36驅(qū)治方法 47監(jiān)測 48檔案管理 6附錄A（規(guī)范性）試劑的配制 7附錄B（資料性）腸道溶組織內(nèi)阿米巴特異性引物序列及檢測結(jié)果圖示 8附錄C（規(guī)范性）常用寄生蟲藥防治藥物及使用規(guī)定 10附錄D（規(guī)范性）操作規(guī)范 10 12DB45/TXXXX—XXXX本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由本標準由廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本文件起草單位：廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所。本文件主要起草人：謝永平、賀會利、馮世文、吳翠蘭、陶立、李軍、彭昊、鐘舒紅、馬春霞。1DB45/TXXXX—XXXX實驗猴寄生蟲病防治技術(shù)規(guī)范本文件界定了實驗猴寄生蟲病防治涉及的術(shù)語和定義，規(guī)定了人工馴繁養(yǎng)殖實驗猴寄生蟲病的診斷方法、防治要求、驅(qū)治方法和監(jiān)測等內(nèi)容。本標準適用于廣西行政區(qū)域內(nèi)人工馴繁養(yǎng)殖實驗猴寄生蟲病的防治。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T18448.2-2008實驗動物弓形蟲檢測方法GB/T18448.7-2008實驗動物瘧原蟲檢測方法GB/T18448.9-2008實驗動物腸道溶組織內(nèi)阿米巴檢測方法GB18596-2001畜禽養(yǎng)殖業(yè)污染物排放標準GB19489-2008實驗室生物安全通用要求GB/T27401-2008實驗室質(zhì)量控制規(guī)范動物檢疫NY/T1168-2006畜禽糞便無害化處理技術(shù)規(guī)范NY/T1949-2010隱孢子蟲卵囊檢測技術(shù)改良抗酸染色法T/CALAS106-2021實驗動物結(jié)腸小袋纖毛蟲核酸檢測方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1實驗猴laboratorymonkey由人工飼育，對其攜帶的微生物進行控制，遺傳背景明確或者來源清楚的，用于科學研究、教學、生產(chǎn)、檢定以及其他科學實驗的動物。實驗猴主要包括食蟹猴和獼猴。3.2寄生蟲病parasitosis由動物界包括原生動物的各種寄生性的無脊椎物種（統(tǒng)稱寄生蟲）引起的疾病。3.3優(yōu)勢蟲種superiorityparasite在一定地區(qū)，某一種動物所感染的寄生蟲蟲種當中，感染分布廣、且危害嚴重的主要寄生蟲蟲種。3.4蠕蟲病helminthosis由吸蟲、絳蟲、線蟲、棘頭蟲引起的寄生蟲病。2DB45/TXXXX—XXXX3.5原蟲病protozoosis由溶組織內(nèi)阿米巴、結(jié)腸小袋纖毛蟲、球蟲、隱孢子蟲等引起的寄生蟲病。3.6體外寄生蟲ectoparasite寄生于動物體外并暫時性吸取營養(yǎng)的寄生蟲。如螨、虱等。4診斷方法4.1直接涂片法在載玻片上滴加一滴生理鹽水，用竹簽挑取少許被檢實驗猴新鮮糞便，或者用刀片刮下少許皮屑，將糞便或者皮屑在生理鹽水中涂抹均勻，置于光學顯微鏡下檢查，或解剖動物后立即用接種環(huán)挑取新鮮小腸、盲腸、結(jié)腸內(nèi)容物或病變組織，分別與生理鹽水混合涂成薄而均勻的薄膜，蓋上蓋玻片后于顯微鏡下檢查。此方法適用于大多數(shù)蟲卵檢測。4.2水洗沉淀法取被檢糞便10～15g于塑料杯中，加水20mL～30mL攪拌成混懸液，用60目銅篩過濾到100mL三角燒杯中，再加入適量蒸餾水充分攪拌混勻，靜置15min，倒去上清液，向沉渣中再加入蒸餾水，調(diào)勻、靜置15min。重復3～4次，直至上層液變清。最后倒去上清液，取沉渣涂片鏡檢。此方法適用于大多數(shù)蟲卵檢測。4.3盧氏碘液染色法取少許新鮮糞便或用吸管吸取4.2水洗沉淀法的量杯底部沉淀物1滴，加盧氏碘液工作液（按附錄A進行）1滴，攪勻，蓋上蓋玻片后，在10×和40×光學顯微鏡下測量觀察。此方法適用于溶組織內(nèi)阿米巴、結(jié)腸小袋纖毛蟲、鞭毛蟲等原蟲檢測。4.4飽和蔗糖漂浮離心法取被檢糞便5g～10g于塑料杯中，加入10mL～20mL自來水充分攪勻，經(jīng)過60目銅絲篩過濾，濾液裝入離心管中，3000rpm離心5min，棄上清，加入適量配置好的飽和蔗糖溶液（按附錄A進行），充分攪拌，使下層沉淀和蔗糖液充分混勻，3000rpm離心5min～10min。用鐵絲吊環(huán)蘸取表層液膜，涂于載玻片上，制片后于10×和40×光學顯微鏡下觀察、測量。此方法適用于隱孢子蟲、鞭蟲的檢測。4.5蟲體濃集法取病料于試管內(nèi)，加入10％氫氧化鈉自熱浸泡過夜或加熱煮沸3min～5min，使皮屑溶解，蟲體沉淀管內(nèi)，靜置20min，棄上清，吸取沉淀，涂于載玻片上，在10×和40×光學顯微鏡下測量觀察。此方法適用于螨蟲檢測。4.6環(huán)介導等溫擴增法取待檢實新鮮糞便2.0g～5.0g，置滅菌燒杯充分攪勻，稱取攪拌后的糞便樣本100mg～300mg至2mL離心管中，按糞便基因組DNA提取說明書提取模板DNA。按照LAMP擴增反應試劑盒配制反應體系，將已配制好、分裝完畢的反應試管置于實時濁度儀(LA-320C，日本榮研公司)密閉進行，濁度儀實時監(jiān)控擴增3DB45/TXXXX—XXXX情況，反應程序為63℃保持60min，之后85℃滅活5min。儀器通過讀取反應管的濁度值繪制濁度曲線，在陰陽性對照成立的情況下，樣品反應管出現(xiàn)濁度上升曲線的為可檢測出其目的基因，判為陽性，反之為陰性。5防治要求5.1人員要求防控的技術(shù)人員要經(jīng)過相關(guān)的技術(shù)培訓，嚴格遵守操作規(guī)程，每年體檢一次，做好人畜防護安全工作。5.2設施、設備要求藥浴池要防滲漏，要求建在地勢較低處，并遠離人畜飲水水源。藥浴、藥淋設備應按操作要求使用。驅(qū)蟲前、浴前、淋前要求先進行小群試驗，確認安全后方可大群驅(qū)蟲、藥浴或藥淋。5.3引進猴要求必須從外場引進猴群時，要確認產(chǎn)地為非疫區(qū)。引進后隔離飼養(yǎng)45d以上，進行觀察、檢疫、監(jiān)測，并進行一次驅(qū)蟲，收集糞便進行發(fā)酵處理。確認為健康后方可與健康猴混群。5.4藥物使用要求藥物配制、使用劑量和使用方法要嚴格按照使用說明書進行。要嚴格按照說明書執(zhí)行休藥期，對未規(guī)定休藥期的藥物，休藥期不應少于28d。5.5飼養(yǎng)管理要求幼猴與成年猴應分開飼養(yǎng)，以減少感染機會。供給全價營養(yǎng)飼料，合理補充青料和必要的添加劑，增強猴只抵抗力。病猴應及時隔離治療，嚴禁混群飼養(yǎng)，以防感染傳播。5.6其他要求驅(qū)蟲過程中，應跟蹤觀察，發(fā)現(xiàn)中毒、傷殘猴應及時采取解毒等治療措施，具體治療措施按附錄D進行。5.7驅(qū)蟲藥物的選擇5.7.1藥物的選擇和使用必須符合《中華人民共和國獸藥典》、《中華人民共和國獸藥規(guī)范》、《獸藥質(zhì)量標準》（第一冊）、（第二冊）、《進口獸藥質(zhì)量標準》的相關(guān)規(guī)定。5.7.2所用獸藥必須來自具有《獸藥生產(chǎn)許可證》和產(chǎn)品批準文號的生產(chǎn)企業(yè)，或者具有《進口獸藥許可證》的供應商。所用獸藥的標簽應符合《獸藥管理條例》的規(guī)定。5.7.3選用的藥物要符合高效、廣譜、安全、價廉、使用方便的原則。5.7.4定期預防性驅(qū)蟲，要選擇對優(yōu)勢蟲種均有效的藥物，如一種藥物不能滿足要求，可以選擇2種或2種以上藥物同時使用，但要注意藥物配伍禁忌，盡量選擇長效驅(qū)蟲藥制劑。5.8圈舍滅蟲及廢棄物無害化處理5.8.1圈舍滅蟲4DB45/TXXXX—XXXX定期在空舍條件下，對圈舍墻壁、地面、圍欄、用具、飼喂工具等噴灑殺蟲藥，能進行火焰消毒的耐高溫設施選用火焰消毒法，以殺滅圈舍內(nèi)的寄生蟲卵?？膳c投藥、藥浴、藥淋同步進行對圈舍墻壁、地面、圍欄、用具、飼喂工具等噴灑殺蟲藥或火焰消毒，也可以根據(jù)發(fā)病情況或具體情況隨時進行。5.8.2廢棄物無害化處理5.8.2.1圈舍內(nèi)糞便要及時清除，糞便集中堆積發(fā)酵處理，利用生物熱殺滅各種寄生蟲和蟲卵，達到消滅傳染源，保障人畜健康及環(huán)境安全。糞便處理應符合NY/T1168的規(guī)定；污水處理符合GB18596的規(guī)定。5.8.2.2病猴尸體及廢棄物按《病死及病害動物無害化處理技術(shù)規(guī)范》規(guī)定執(zhí)行，嚴禁將未經(jīng)處理的病猴尸體、廢棄物直接喂犬或隨地拋棄。6驅(qū)治方法6.1蠕蟲病采用高效驅(qū)蟲藥每年全群驅(qū)蟲，一年進行三次，第一次在春季（3～4月第二次在夏季（7～8月氣溫較高，猴群在室外運動頻繁時期進行，第三次在秋冬季（11～12月）。常用防治藥物及使用規(guī)定按附錄C進行。6.2原蟲病采用高效抗驅(qū)蟲藥每年全群驅(qū)蟲，一年進行2～4次，春季（3～4月），秋季（9～10月），根據(jù)寄生蟲的流行情況適當調(diào)整。常用防治藥物及使用規(guī)定按附錄C進行。6.3螨蟲病發(fā)現(xiàn)病猴后及時隔離治療，選擇長效驅(qū)蟲藥，一年進行三次，分別在1月、3月、10月進行驅(qū)蟲，至少用藥2次，用藥間隔7d～8d。常用防治藥物及使用規(guī)定按附錄C進行。7監(jiān)測7.1抽樣數(shù)量及比例猴群監(jiān)測（以猴群為單位抽樣數(shù)量為猴數(shù)量的510％,其中幼猴30種猴40青年（商品用）猴30％。對規(guī)模小于100只的猴群，抽樣數(shù)量不應少于10只。7.2監(jiān)測時間蠕蟲及原蟲在驅(qū)蟲前1周內(nèi)或驅(qū)蟲后7d～15d內(nèi)進行監(jiān)測，對出售的商品猴群隨時進行監(jiān)測。螨蟲等體外寄生蟲在每年秋末春初，冬季高發(fā)季節(jié)監(jiān)測。7.3監(jiān)測方法蠕蟲采用糞便檢查孕卵節(jié)片、幼蟲和蟲卵的方法，對病死猴可采用全身性蠕蟲學檢查法；原蟲采用直接直接涂片法、水洗沉淀法、盧氏碘液染色法、飽和蔗糖漂浮離心法等，其中溶組織內(nèi)阿米巴可采用溶組織內(nèi)阿米巴核酸檢測方法（見附錄B），結(jié)腸小袋纖毛蟲按T/CALAS106-2021進行檢測，弓形蟲按5DB45/TXXXX—XXXX照GB/T18448.2進行檢測，瘧原蟲按照GB/T18448.7進行檢測；體外寄生蟲采用直接檢查法、蟲體濃集法等。7.4監(jiān)測指標及計算方法7.4.1防治（驅(qū)蟲）密度防治（驅(qū)蟲）密度按式（1）計算： 式中：M—防治（驅(qū)蟲）密度；Q1—防治（驅(qū)蟲）猴數(shù)；Y1—猴群總數(shù)量。7.4.2感染率感染率按式（2）計算：式中：G—感染率；Y2—感染某種蟲的猴數(shù)量；Y3—抽檢猴的數(shù)量。7.4.3蟲卵（包囊）減少率蟲卵（包囊）減少率按式（3）計算：式中：C—蟲卵（包囊）減少率；Q2—驅(qū)蟲前每克糞便中的蟲卵（包囊）數(shù)；Q3—驅(qū)蟲后每克糞便中的蟲卵（包囊）數(shù)。7.4.4蟲卵轉(zhuǎn)陰數(shù)蟲卵（包囊）轉(zhuǎn)陰數(shù)按式（4）計算： 式中：Y—蟲卵（包囊）轉(zhuǎn)陰率；Y3—抽檢猴的數(shù)量；Y4—轉(zhuǎn)陰猴的數(shù)量。6DB45/TXXXX—XXXX7.5監(jiān)測評價根據(jù)監(jiān)測指標及計算結(jié)果，了解實驗猴寄生蟲流行情況，指導驅(qū)蟲并對驅(qū)蟲效果進行評價。8檔案管理建立防治檔案，檔案記錄內(nèi)容包括防治數(shù)量、用藥品種、使用劑量、環(huán)境與糞便無害化處理、發(fā)病率、病死率及死亡原因、診治情況等。7DB45/TXXXX—XXXX（規(guī)范性）試劑的配制A.1盧氏碘液儲存液配制方法按照GB/T18448.9-2001的規(guī)定進行配制。A.2盧氏碘液工作液配制方法取A.1儲存液5mL，加入20mL生理鹽水，混勻后儲存于棕色玻璃瓶中，隨用隨取。A.3飽和蔗糖溶液配制方法按照NY/T1949-2010中附錄A的規(guī)定進行配制。8DB45/TXXXX—XXXX（資料性）腸道溶組織內(nèi)阿米巴特異性引物序列及檢測結(jié)果圖示B.1溶組織內(nèi)阿米巴引物擴增的目的基因16SrRNA基因B.2溶組織內(nèi)阿米巴外引物amb-F3：GGCGCGTAAATTACCCAAamb-B3：GCGTTTTAATCACAACAACTTB.3溶組織內(nèi)阿米巴內(nèi)引物amb-FIP：CCTTCAAGACATGCTTACGCACCAACAGATAGAAGAGGTAGTGACamb-BIP：GAGTAAGAAGCAAAGAGTCTTACGATTGGAGCTGGAATTACCGB.4溶組織內(nèi)阿米巴環(huán)引物LB:AATCAATTGGAGGGCAAGTCTGB.5試劑B.5.1無Rnase去離子水的配制去離子水加入0.1％的DEPC(焦碳酸二乙酯)混合均勻，室溫靜置過夜，121℃高壓滅菌15min，冷卻備用。B.5.2糞便基因組DNA試劑盒用于糞便基因組DNA的提取試劑（北京康為世紀生物科技有限公司提供），或其他等效產(chǎn)品。B.5.3Loopamp。擴增反應試劑盒Loopamp。擴增反應試劑（榮研生物科技（中國）有限公司提供），或其他等效產(chǎn)品。B.5.4陽性對照用限制性內(nèi)切酶HindⅢ消化λ噬菌體DNA后，取其片段（6.557bp）重組入質(zhì)粒所得。B.5.5陰性對照陰性對照使用滅菌去離子水。B.6操作程序B.6.1待檢樣品DNA提取將糞便樣本稱取100mg～300mg至2mL離心管中，按糞便基因組DNA提取說明書提取模板DNA，獲得50μLDNA。所提取的模板DNA，直接放入PCR管中進行后續(xù)反應或置-20℃保存?zhèn)溆?。B.6.2LAMP樣品反應體系配制9DB45/TXXXX—XXXXB.6.2.1LAMP樣品反應體系2×反應緩沖液12.5μLBstDNA聚合酶1μLamb-F35pmolamb-B35pmolLB20pmolamb-FIP40pmolamb-BIP40pmol去離子水（DW）補足23μL。分裝后，放入微量離心機中離心數(shù)秒（瞬時離心），以此作為預混溶液，配制好的預混溶液立即使B.6.2.2對照反應體系2×反應緩沖液引物溶液DNABstDNA聚合酶去離子水（DW）2.5補足23B.6.2.3預混溶液與樣本溶液混合添加樣本溶液（溶組織內(nèi)阿米巴DNA）2μL，使總量達到25μL，對照反應中，陰性對照使用去離子水2μL，陽性對照使用陽性對照DNA2μL，合上蓋子輕擊使溶液充分混勻后瞬時離心。B.6.2.4上機檢測將已配制好、分裝完畢的反應試管置于實時濁度儀(LA-320C，日本榮研公司)密閉進行，濁度儀實時監(jiān)控擴增情況，反應程序為63℃保持60min，之后85℃滅活5min。B.6.3結(jié)果判定實時濁度儀實時監(jiān)測反應擴增情況，儀器通過讀取反應管的濁度值繪制濁度曲線，在陰陽性對照成立的情況下，樣品反應管出現(xiàn)濁度上升曲線的為陽性結(jié)果，沒有出現(xiàn)濁度上升曲線的為陰性結(jié)果(見圖B.1)B.7LAMP檢測結(jié)果圖示LAMP檢測結(jié)果見圖B.1。圖B.1腸道溶組織內(nèi)阿米巴LAMP檢測結(jié)果圖DB45/TXXXX—XXXX（規(guī)范性）常用寄生蟲藥防治藥物及使用規(guī)定表C.1給出了常用寄生蟲藥防治藥物及使用規(guī)定。表C.1常用寄生蟲藥防治藥物及使用規(guī)定寄生蟲病名稱選擇的藥物名稱制劑用法與用量內(nèi)服，一次量5～10）mg/kg體重內(nèi)服，一次量3～5）mg/kg體重內(nèi)服，一次量3～5）mg/kg體重內(nèi)服，一次量10～20）mg/kg體重，連用（5~wormwood內(nèi)服，一次量5～10）g，連用（5～10）d。或藥浴、噴淋5～8）mg/LD.1檢測過程中防止交叉污染的措施DB45/TXXXX—XXXXD.1.1采樣和制樣過程采樣和制樣工具，應清洗干凈，121℃,15min～20min滅菌，一套清潔工具僅限于一個樣品使用。存放樣品的容器應該經(jīng)過清洗、滅菌，或為滅菌一次性容器。D.1.2檢測過程D.1.2.1PCR實驗室應分出試劑準備區(qū)、樣品制備區(qū)、產(chǎn)物擴增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)。將模板提取、LAMP反應液配制、LAMP擴增及鑒定等步驟分區(qū)或分室進行。實驗室的操作流程應從“清潔區(qū)”到“污染區(qū)”單方向