生化筆記第二部分核酸化學(xué)

核酸化學(xué)一、核酸種類和組成單位1、依據(jù)核酸化學(xué)組成和生物學(xué)功效,將核酸分為:核糖核酸（RNA）和脫氧核糖核酸(DNA)全部細(xì)胞都同時(shí)含有DNA和RNA兩種核酸。病毒只含一個(gè)核酸,DNA或RNA,故有DNA病毒和RNA病毒之分。多數(shù)細(xì)菌病毒（噬菌體）屬DNA病毒,而植物和動(dòng)物病毒多為RNA病毒。DNA:關(guān)鍵存在于細(xì)胞核（真核細(xì)胞,98%以上）,是染色質(zhì)關(guān)鍵成份;原核生物DNA關(guān)鍵存在于類核中;在核外也存在有少許DNA,如線粒體DNA、葉綠體DNA以及細(xì)菌質(zhì)粒（細(xì)菌染色體外能夠進(jìn)行自我復(fù)制遺傳單位）。RNA關(guān)鍵存在于細(xì)胞質(zhì)中:mRNA:約占細(xì)胞總RNA5%,在蛋白質(zhì)合成中起模板作用;rRNA:占細(xì)胞總RNA80%,是核糖體組分,是合成蛋白質(zhì)場(chǎng)所;tRNA:占細(xì)胞總RNA10-15%,蛋白質(zhì)合成中起攜帶活化氨基酸作用;2、組成:核酸是由核苷酸組成,核苷酸是核苷磷酸酯,核苷由堿基和核糖/脫氧核糖組成,堿基有嘌呤和嘧啶兩類。DNA組成:脫氧核糖、磷酸、A、G、C、TRNA組成:核糖、磷酸、A、G、C、U（1）堿基:NH2OCH3OONH2OOONH2胞嘧啶胸腺嘧啶尿嘧啶鳥嘌呤腺嘌呤嘌呤和嘧啶環(huán)中均含有共軛雙鍵,所以對(duì)波長(zhǎng)260nm左右紫外光有較強(qiáng)吸收,這一關(guān)鍵理化性質(zhì)被用于對(duì)核酸、核苷酸、核苷及堿基進(jìn)行定性定量分析。（4）戊糖:DNA分子核苷酸糖是β-D-2-脫氧核糖,RNA中為β-D-核糖。（3）磷酸:生物體內(nèi)多數(shù)核苷酸磷酸基團(tuán)位于核糖第五位碳原子上。二、核酸分子結(jié)構(gòu)（一）DNA分子結(jié)構(gòu)1、一級(jí)結(jié)構(gòu)DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)指是組成DNA分子脫氧核苷酸連接方法和排列次序。DNA是由很多個(gè)dAMP、dGMP、dCMP和dTMP經(jīng)過3’,5’-磷酸二酯鍵連成無分支雙鏈線狀或環(huán)狀多核苷酸。生物體性狀由DNA決定,生物性狀多個(gè)多樣,所以在DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)上,一定是不一樣段落有不一樣功效,不一樣生物性狀由對(duì)應(yīng)DNA片段來決定;核酸為多聚核苷酸,相鄰2個(gè)核苷酸間以3’,5’-磷酸二酯鍵連接。DNA分子中鏈骨架是固定不變,脫氧核糖核苷酸排列次序?qū)嵸|(zhì)上是堿基排列次序。核酸鏈簡(jiǎn)寫式:核酸分子簡(jiǎn)寫式可簡(jiǎn)明表示高度復(fù)雜核酸分子。簡(jiǎn)寫式表示是核酸分子一級(jí)結(jié)構(gòu),即核酸分子中核苷酸（或堿基）排列次序。書寫方法由5’→32、二級(jí)結(jié)構(gòu):DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)是核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)。雙螺旋骨架由糖和磷酸基組成,兩股鏈之間堿基互補(bǔ)配對(duì),是遺傳信息傳輸者,DNA半保留復(fù)制基礎(chǔ),結(jié)構(gòu)關(guān)鍵點(diǎn):a.DNA是一反向平行互補(bǔ)雙鏈結(jié)構(gòu)親水脫氧核糖基和磷酸基骨架位于雙鏈外側(cè),而堿基位于內(nèi)側(cè),堿基之間以氫鍵相結(jié)合,其中,腺嘌呤一直與胸腺嘧啶配對(duì),形成兩個(gè)氫鍵,鳥嘌呤一直與胞嘧啶配對(duì),形成三個(gè)氫鍵。b.DNA是右手螺旋結(jié)構(gòu)螺旋直徑為2nm。每旋轉(zhuǎn)一周包含了10個(gè)堿基,每個(gè)堿基旋轉(zhuǎn)角度為36度。螺距為3.4nm,每個(gè)堿基平面之間距離為0.34nm。c.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定維系橫向靠互補(bǔ)堿基氫鍵維系,縱向則靠堿基平面間疏水性堆積力維持,尤以后者為關(guān)鍵。3、三級(jí)結(jié)構(gòu):三級(jí)結(jié)構(gòu)是在雙螺旋基礎(chǔ)上深入扭曲形成超螺旋,使體積壓縮。在真核生物細(xì)胞核內(nèi),DNA三級(jí)結(jié)構(gòu)與一組組蛋白共同組成核小體。在核小體基礎(chǔ)上,DNA鏈經(jīng)反復(fù)折疊形成染色體。（二）RNA分子結(jié)構(gòu)1、、tRNA結(jié)構(gòu):tRNA由73~93個(gè)核苷酸組成,分子量為25000~30000dalton,沉降系數(shù)4S,含較多稀有堿基（修飾堿基）,占總RNA16%,種類多。（1）一級(jí)結(jié)構(gòu):分子量最小,含75～90個(gè)核苷酸,3′－末端都含有CPCPAOH結(jié)構(gòu),即最終一個(gè)是腺苷（核糖3′位非磷酸化）;（2）二級(jí)結(jié)構(gòu):不一樣tRNA含有相同高級(jí)結(jié)構(gòu),tRNA分子單股鏈經(jīng)過本身折疊形成四個(gè)螺旋區(qū)和四個(gè)環(huán)基礎(chǔ)結(jié)構(gòu),類似一個(gè)三葉草,稱為三葉草結(jié)構(gòu)。tRNA分子中含有氨基酸臂、二氫尿嘧啶環(huán)、反密碼環(huán)、額外環(huán)和TYC環(huán)五部分。①氨基酸臂:7bp組成,富含G,5’-pG或pC,3’-CCA-OH,氨基酸連接在腺苷酸殘基(A)上。②TψC環(huán):由7個(gè)堿基組成,參與tRNA與核糖體表面結(jié)合。③額外環(huán)或可變環(huán):堿基種類和數(shù)量（3~18個(gè)堿基）高度可變,并富含稀有堿基。環(huán)大小與生物種類相關(guān),作為tRNA分類指標(biāo)。④反密碼子環(huán):由7個(gè)堿基組成,處于中間位3個(gè)堿基為反密碼子,常含有次黃嘌呤核苷酸。反密碼子可與mRNA中密碼子結(jié)合。⑤二氫尿嘧啶環(huán):由8~12個(gè)堿基組成,具2個(gè)二氫尿嘧啶(DHU)。（3）三級(jí)結(jié)構(gòu):tRNA三級(jí)結(jié)構(gòu):tRNA三維結(jié)構(gòu)是倒“L”形。（4）tRNA作用:是攜帶活化氨基酸參與蛋白質(zhì)合成。2、mRNA結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞mRNA3′末端有一段可長(zhǎng)達(dá)200個(gè)左右多聚腺苷酸,稱為“尾”結(jié)構(gòu)。表示為polyA5′;末端有一個(gè)甲基化鳥苷酸,稱為“帽”結(jié)構(gòu)。表示為:m7GPPPXmPY.這種“尾”和“帽”結(jié)構(gòu)在mRNA功效中相關(guān)鍵作用。經(jīng)典真核mRNA結(jié)構(gòu)次序是:帽子結(jié)構(gòu)區(qū)-5’非編碼區(qū)-起始密碼-編碼-終止密碼-3’真核生物mRNA一級(jí)結(jié)構(gòu)特點(diǎn):真核生物帽子結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度與生物進(jìn)化程度關(guān)系親密。mRNA5’-端帽子結(jié)構(gòu)是mRNA翻譯起始必需結(jié)構(gòu),對(duì)核糖體對(duì)mRNA識(shí)別提供了信號(hào);這種帽子結(jié)構(gòu)還可能增加mRNA穩(wěn)定性,保護(hù)mRNA免遭5’→3‘核酸外切酶攻擊,同時(shí)也與mRNA翻譯活性相關(guān)。絕大多數(shù)真核mRNA3’-末端有一段長(zhǎng)約200個(gè)殘基Poly（A）。原核生物mRNA通常無此結(jié)構(gòu)。Poly（A）尾巴是轉(zhuǎn)錄后在核內(nèi)加上。Poly（A）尾巴功效可能與mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)送到細(xì)胞質(zhì)相關(guān)。不過相當(dāng)數(shù)量沒有polyA尾巴mRNA如組蛋白mRNA,也能經(jīng)過核膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。這種結(jié)構(gòu)可能對(duì)真核mRNA翻譯效率含有某種作用,使mRNA較輕易被核糖體識(shí)別,并能穩(wěn)定mRNA結(jié)構(gòu),保持一定生物半衰期。原核生物mRNA通常為多順反子(polycistron),即在同一mRNA中含有編碼多個(gè)蛋白質(zhì)信息(一個(gè)基因即一個(gè)順反子);真核mRNA通常是單順反子,一個(gè)mRNA只能編碼一條多肽鏈。3、、rRNA結(jié)構(gòu)種類較多,分子中修飾成份較少;rRNA分子量為103~106D,存在于核糖體中,核糖體中有60%是rRNA,其它40%是蛋白質(zhì)。原核生物大腸桿菌rRNA有5S、16S和23SrRNA三種,動(dòng)物細(xì)胞有5S、5.8S、18S和28SrRNA四種三、核酸理化性質(zhì)（一）、核酸通常性質(zhì)1、溶解性RNA為白色粉末狀,DNA是白色纖維狀固體,二者均溶于水,而不溶于通常有機(jī)溶劑中,故常見冷乙醇從水溶液中將核酸沉淀出來。2、兩性性質(zhì)核酸是兩性電解質(zhì),但酸性強(qiáng),與金屬離子結(jié)合成鹽,也可與堿性蛋白（組蛋白）結(jié)合;介質(zhì)pH大于4時(shí),呈陰離子,電泳時(shí)向陽極移動(dòng);DNA在pH4~11間最穩(wěn)定,超出此范圍易變性。（二）核酸紫外吸收特征核酸分子中嘌呤和嘧啶堿基中含有共軛雙鍵體系,所以含有特殊紫外吸收光譜,其最大吸收峰位于260nm處。利用這一性質(zhì)可定量測(cè)定核酸含量或判定核酸純度。（三）核酸變性及復(fù)性1、核酸變性⑴概念:核酸變性是指因一些理化原因影響使維持核酸空間結(jié)構(gòu)氫鍵和疏水鍵斷裂,雙螺旋結(jié)構(gòu)解體,但不包含核苷酸間共價(jià)鍵斷裂。核酸變性后,粘度降低,紫外吸收值增高(增色效應(yīng)),生物功效消失。⑵影響變性原因:破壞雙螺旋穩(wěn)定性原因都可使DNA變性。DNA分子中堿基處于配對(duì)和不配對(duì)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài),很多原因會(huì)引發(fā)它向不配對(duì)方向轉(zhuǎn)變,即引發(fā)DNA變性。如高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑(乙醇、丙酮等)、尿素、酰胺等試劑、射線等。高溫:DNA稀鹽溶液加熱到80~100℃,幾分鐘內(nèi)雙螺旋鍵即解開,形成無規(guī)則線團(tuán)。離子強(qiáng)度:提升溶液離子強(qiáng)度,可中和DNA分子鏈上磷酸基團(tuán)負(fù)電荷,降低它們之間排斥力,穩(wěn)定DNA結(jié)構(gòu)。DNA通常保留在1molNaCl中。極端pH值:pH﹤1時(shí),DNA磷酸二酯鍵會(huì)被水解;pH﹥11.3時(shí),DNA全部氫鍵斷裂。疏水作用:甲醇可增加堿基溶解度,三氟醋酸鈉可降低DNA分子疏水作用,破壞雙螺旋結(jié)構(gòu)引發(fā)變性。⑶DNA熔點(diǎn)（Tm）:DNA熱變性過程中光吸收達(dá)成最大吸收二分之一時(shí)溫度稱為DNA解鏈溫度(簡(jiǎn)寫Tm)或熔點(diǎn),用Tm表示。DNATm值通常在70~85℃熱變性是在很狹溫度范圍內(nèi)突發(fā)躍變過程,很像結(jié)晶達(dá)成熔點(diǎn)時(shí)熔化現(xiàn)象,故名熔解溫度。（4）Tm影響原因:DNA均一性高:Tm范圍越小。DNA(G+C)含量:Tm值高低取決于DNA分子中(G+C)含量。(G+C)含量越高,Tm值越高。故測(cè)定Tm,可反應(yīng)DNA分子中G,C含量。公式以下:(G+C)%=(Tm–69.3)×2.442、核酸復(fù)性⑴概念變性DNA在合適條件下(除去變性原因),可使兩條分開鏈根據(jù)堿基配對(duì)規(guī)律重新締合成雙螺旋結(jié)構(gòu),這一過程稱為復(fù)性。復(fù)性后DNA其理化性質(zhì)和生物功效都得到部分恢復(fù)。復(fù)性DNA溶液紫外吸收下降稱為減色效應(yīng)。⑵影響復(fù)性原因①溫度和時(shí)間通常認(rèn)為比Tm低25℃左右溫度是復(fù)性最好條件,越遠(yuǎn)離此溫度,復(fù)性速度就越慢。復(fù)性時(shí)溫度下降必需是一緩慢過程,若在超出Tm溫度下快速冷卻至低溫(如4℃以下),復(fù)性幾乎是及不可能,核酸試驗(yàn)中常常以此方法保持DNA變性(單鏈)降溫時(shí)間太短以及溫差大均不利于復(fù)性。②DNA濃度:濃度越大,復(fù)性越快。③DNA次序復(fù)雜性:簡(jiǎn)單次序DNA分子,如多聚(A)和多聚(T)這二種單鏈序列復(fù)性時(shí),互補(bǔ)堿基配對(duì)較易實(shí)現(xiàn)。次序復(fù)雜DNA,如小牛DNA非反復(fù)部分,通常以單拷貝存在于基因組中,這種復(fù)雜特定序列要實(shí)現(xiàn)互補(bǔ),顯然要比簡(jiǎn)單序列困難得多。四、核酸分離與純化（一）分離核酸通常標(biāo)準(zhǔn)提取時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn):1、預(yù)防核酸酶降解:細(xì)胞內(nèi)凡有核酸部位,都有降解該核酸酶存在。故應(yīng)加入酶抑制劑降低其活性,如檸檬酸鈉,EDTA等;2、預(yù)防化學(xué)原因降解:提取時(shí)常見到強(qiáng)酸強(qiáng)堿,要注意強(qiáng)酸強(qiáng)堿降解作用;3、預(yù)防物理原因降解:應(yīng)在低溫和避免猛烈攪拌下進(jìn)行;（二）DNA分離純化1、DNP蛋白提取細(xì)胞提取物加1mol/LNaClDNP溶解DNP溶解分離（DNP和RNP)RNP沉淀稀釋NaCl至0.14mol/L離心DNP溶液DNP沉淀DNP蛋白2、除去DNP中蛋白質(zhì)（1）SDS法SDS（十二烷基硫酸鈉）可使蛋白質(zhì)變性,從而使DNA與蛋白質(zhì)分開;（2）苯酚法苯酚變性蛋白質(zhì)在苯酚相,酒精DNP蛋白DNA在水相離心DNA沉淀3、DNA純化（1）蔗糖密度梯度離心:分離分子量大小不等DNA（2）氯化銫密度梯度離心分離雙鏈和單鏈DNA;（3）柱層析:分離天然DNA和變性DNA三.RNA分離純化（三）RNA分離純化1、