.哺乳動物組織基因組DNA提取

11三月2024.哺乳動物組織基因組DNA提取*2一、實驗目的(ExperimentalPurpose)Aftertheexperimentdone,studentsshouldbeabletoknowhowtoextractgenomicDNAfrommammaltissue.掌握動物基因組DNA提取的操作方法。*3細菌-原核細胞(prokaryote)無真正的細胞核真核細胞(eukaryote)有真正的細胞核，還有很復雜的細胞器*4動物細胞特有中心體，高等植物細胞特有細胞壁，葉綠體和液泡動物細胞(animalcell)植物細胞(plantcell)*5二、實驗原理(ExperimentalPrinciple)Intheproceduredescribedhere,theSDS(sodiumdodecylsulfate)areaddedtodenatureproteinsandsolubilizelipidsinmembranesleadingtocelllysis.ThecelllysateisoftentreatedwithenzymesthathydrolyzeRNAandproteins.

本實驗利用去垢劑SDS(十二烷基磺酸鈉)是為了使蛋白變性并溶解細胞膜中的脂質從而導致細胞裂解，而細胞裂解物又常用蛋白酶K和RNA酶進行水解處理。*6真核生物染色體DNA組裝不同層次的結構*7Thisisgenerallyfollowedbyphenolofphenol:chloroformextractiontoremovetheremainingproteins,whichwilleitherentertheorganicphaseor,ifdenatured,appearattheinterphase.Chloroformtreatmentisusedtoremovethephenol,andalcoholprecipitationconcentratestheDNAwhileremovingimpurity.

隨后用酚︰氯仿進行抽提，以去除殘留的蛋白質，這時蛋白質將進入有機相，或者假如己變性的話將呈現(xiàn)在有機相與水相之間。氯仿處理是為了去除苯酚，而乙醇沉淀處理則可以濃縮DNA，同時去除核苷酸、氨基酸以及低分子量的寡核苷酸和肽。*8Asafurtherprecaution,ethylenediaminetetraace-ticacid(EDTA)isinclude-edinthebufferstochelateMg2+.Thiswillreducedeoxyribonuclease(DNase)activitybecauseoftheMg2+requirementoftheseenzymes.為了進一步保護DNA樣品的完整性，通常需要在緩沖液中添加乙二胺四乙酸(EDTA)以整合Mg2+，這樣將會減少脫氧核糖核酸酶(DNase)的活性，因為該酶必須在有Mg2+存在時才會起作用。*9ThemethoddescribedhereresultinDNAthatiseasilycutwithrestrictionenzymesand,therefore,isusefulforSouthernHybridizationstudies.IftheDNAistobeusedtoconstructaclonebank,highermolecularweightDNAisdesirable,sothevortexstepshouldbeeliminated.

本實驗方法分離得到的染色體DNA樣品易被限制酶切割，因此，較適用于Southern雜交的研究。如果所制備的基因組DNA是用于構建克隆文庫，要求得到較大分子量的DNA，則必須省略其中的振蕩步驟。*10核酸的分離純化、測定及研究方法一、

分離核酸的一般原則

因為遺傳信息全部貯存在核酸的一級結構中，故完整的一級結構是保證核酸結構與功能研究的基礎。*11（一）核酸的分離和純化時應遵循兩個原則

①保證核酸一級結構的完整性；

②排除其它分子的污染。（二）核酸的純度要求

①

核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；②其它生物大分子如蛋白質、多糖和脂類分子的污染應降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子時，應去除RNA，反之亦然。*12（三）核酸分離純化的注意事項為保證分離核酸的完整性和純度，在實驗中應注意：①盡量簡化操作步驟，縮短提取過程，以減少各種有害因素對核酸的破壞；②減少化學物質對核酸的降解，為避免過酸、過堿對核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操作多在pH4～10條件下進行；③防止核酸的生物降解。細胞內或外來的各種核酸酶水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，直接破壞核酸的一級結構。其中DNA酶需要金屬二價陽離子Mg2+，Ca2+的激活，因此使用金屬離子螯合劑，如EDTA或檸檬酸鹽等基本上可以抑制DNA酶的活性。而RNA酶不但分布廣泛、極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸堿、不易失活，所以生物降解是RNA提取過程中的主要危害因素；④減少物理因素對核酸的降解，物理降解因素主要是機械剪切力，其次是高溫。

*13高溫：如長時間煮沸，除水沸騰帶來的剪切力外，高溫本身對核酸分子中的某些化合鍵也有破壞作用。核酸提取過程中常規(guī)操作溫度為0～4℃以降低核酸酶的活性從而減少對核酸的生物降解。

機械剪切力：包括強力高速的溶液振蕩、攪拌，細胞突然置于低滲液中；細胞爆炸式地破裂及DNA樣品的反復凍融等。這些操作細節(jié)在實驗操作中應加倍注意。機械剪切作用的主要危害對象是大分子量的線性DNA分子，如真核細胞的染色體DNA等。

*14二、核酸分離純化的一般步驟破碎細胞→去除蛋白質、多糖、脂類等生物大分子→沉淀核酸→去除鹽類、有機溶劑等雜質→純化干燥→溶解。核酸提取方案，應根據(jù)具體生物材料和待提取核酸分子的特點而定。對于某特定細胞器中富集的核酸分子，采用先提取細胞器后再提取目的核酸分子的方案，可獲得完整性和純度兩方面質量均高的核酸分子。*15三、試劑與器材（Reagentsandapparatus）

Ⅰ.Instruments

Highspeedrefrigeratedcentrifuge（高速冷凍離心機）、Glasshomogenizer（玻璃勻漿器）

、ElectrophoresisSystem（電泳系統(tǒng)）

、Ultraviolettransilluminator（紫外透射儀）

、Ultracoldstoragefreezer（超低溫冰箱）

、Autoclave（高壓滅菌鍋）

、Pipettes（微量加樣器）

、Electronicbalance（電子天平）

、

Acidometer（酸度計）*16Ⅱ.Materials

Liverofmice*17Ⅲ.ReagentsTris：Tris(Hydroxymethyl)aminomethane

（三羥甲基氨基甲烷）、SDSsodiumdodecylsulfate,sodiumsalt(十二烷基硫酸鈉)、EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid(乙二胺四乙酸)、HClhydrochloricacid（鹽酸）、NaOHSodiumhydroxide（氫氧化鈉）、Sodiumacetate(醋酸鈉)、Aceticacid（冰乙酸）、Phenol（平衡酚）、Chloroform（氯仿）、Isoamylol（異戊醇）、Ethanol（乙醇）、TEbufferProteaseK（蛋白酶K）、RNaseA（RNA酶）、Agarose（瓊脂糖）、DNAmolecularweightmarkers（DNA相對分子質量標準物[MarkDNA]）、Boricacid硼酸、Sugar蔗糖、Bromophenolblue溴酚藍、Fluorescentdye(熒光染料)[Gelview]*18溶液的配制摩爾質量的計算:質量(g)分子量例：5mol/LNaCl分子量58.4450ml

x58.44密度的計算：÷0.05(L)＝5（mol/L）x＝14.61（g）÷體積(L)＝摩爾體積（mol/L）質量(g)體積（V）＝密度（g/ml）*19(1)5mol/L氯化鈉（NaCl）：溶解292g氯化鈉于足量的水中，定容至1000ml。(2)0.5mol/L乙二胺四乙酸（EDTA）:配制等摩爾的Na2EDTA和NaOH溶液（0.5mol/L），混合后形成EDTA的三鈉鹽。或稱取186.2g的Na2EDTA·2H2O和20g的NaOH，pH調至8.0，并溶于約900ml水中，定容至1000ml。（3)3mol/L乙酸鈉（NaAc）：溶解204g的三水乙酸鈉于約450ml水中，用冰乙酸調溶液的pH至5.2，再加水定容到500ml。*20(4)10％十二烷基硫酸鈉（SDS）：稱取10gSDS慢慢轉移到約含90ml的水的燒杯中，用磁力攪拌器攪拌直至完全溶解定容至100ml。(5)5mol/L氫氧化鈉（NaOH）：溶解20g氫氧化鈉顆粒于約90ml水的燒杯中（磁力攪拌器攪拌），完全溶解后用水定容至100ml。(6)1mol/L鹽酸（HCl）：加8.6ml的濃鹽酸至91.4ml的水中。*21(7)20mg/ml蛋白酶K（proteinaseK）：將200mg的蛋白酶k加入到9.5ml水中，輕輕搖動，直至蛋白酶K完全溶解。不要渦旋混合。加水定容到10ml，然后分裝成小份(1ml)貯存于-20℃。(8)10mg/mlRnase（無DNase）（DNase-freeRNase）：溶解10mg的胰蛋白RNA酶于1ml的10mmol/L的乙酸鈉水溶液中（pH5.0）。溶解后于水浴中煮沸15min，使DNA酶失活。用1mol/L的Tris-HCl調pH至7.5，于-20℃貯存。（配制過程中要戴手套）*22(9)

1mol／L

Tris緩沖液（Tris·HClbuffer）

將121g的Tris堿溶解于約0.9L水中，再根據(jù)所要求的pH（25℃下）加一定量的濃鹽酸（11.6N），用水調整終體積至1L。濃鹽酸的體積（ml）pH148.621

28.5

38

46

56

66

71.3

769.08.8

8.6

8.4

8.2

8.0

7.8

7.6

7.4

7.2*23四、實驗步驟(ExperimentalProcedures)

冰浴處理生理鹽水玻璃勻漿器

冰冷的生理鹽水清洗配制工作液處死小鼠取出肝臟

組織勻漿液

酶解液2ml勻漿液

組織細胞液

玻璃勻漿器勻漿移至1.5ml離心管5000r／min30—60s加400ul吹散加400ul離心無菌水酶解液水浴處理（55℃、12—18h）

*24工作液配置：貯備液摩爾濃度×貯備液（體積）＝工作液摩爾濃度×工作液（體積）例：組織勻漿液（10ml）貯備液摩爾濃度：5mol／LNaCl工作液摩爾濃度：100mmol／L5mol／L×x＝0.1mol／L×10mlx＝0.2ml*25組織勻漿液（裝入10ml離心管中）10ml100mmol/LNaCl：

0.2ml（5mol/LNaCl）25mmol/LEDTA：

0.5ml（0.5mol/LEDTApH8.0)10mmol/LTris·HCl：

0.1ml（1mol/LTris·HClpH8.0)加三蒸水:9.2ml*26酶解液（裝入1.5ml離心管中）1ml200mmol/LNaCl：0.04ml

（5mol/LNaCl）50mmol/LEDTA：0.1ml

（0.5mol/LEDTApH8．0)20mmol/LTris·HCl：0.02ml（1mol/LTris·HClpH8．0)1%SDS：

0.5ml（2%SDS）200μg/mL蛋白酶K：

0.02ml

（10mg/ml）

加三蒸水:0.32ml*27無DNA酶的RNA酶（-20℃保存）

10mmol/LTris·HCl將胰RNA酶溶于濃度10mg／mL

15mmol/LNaCl

于100℃水浴處理15min以降解DNA酶緩慢冷卻到室溫。*28四、實驗步驟(ExperimentalProcedures)

等量分裝在兩支離心管內加入20ul的RNase加入等體積①提取液4℃10min酶解樣品待抽提的樣品抽提

靜置離心

配制TE緩沖液

加等體積②提取液500ul10000r／min離心10min4℃10min

移出水相至離心管抽提

靜置

10000r／min離心10min加1/10加2倍放入離心移出水相NaAc無水乙醇

-20℃1-2h12000r／min離心15min加入超低溫冰箱融化、離心棄上清液

洗滌12000r／min離心15min干燥4℃

75%冷乙醇離心棄上清液加TE50μl存放DNA

*29平衡酚(pH8.0)：氯仿：異戊醇：25：24：1

(體積比)即配即用

每管加500ul平衡酚(pH8.0)：250ul氯仿：240ul異戊醇：10ul*30氯仿：異戊醇：24：1(體積比)即配即用

每支試管加500μl氯仿：480μl異戊醇：20μl*31TE緩沖液1ml10mmol/LTris·HCl：

10μl（1mol/LTris·HClpH8.0)1mmol/LEDTA：

2μl（0.5mol/LEDTApH8.0)加三蒸水0.988ml至1ml*32核酸的酚抽提原理：交替使用酚、氯仿兩種蛋白質變性劑，更有效去除蛋白質。氯仿還可加速有機相與水相的分層。異戊醇：抑制界面泡沫的形成。標準程序：酚——酚-氯仿——氯仿。*33酚抽提除去蛋白質的示意圖*34四、實驗步驟(ExperimentalProcedures)

等量分裝在兩支離心管內加入20ul的RNase加入等體積①提取液4℃10min酶解樣品待抽提的樣品抽提

靜置離心

配制TE緩沖液

加等體積②提取液500ul10000r／min離心10min4℃10min

移出水相至離心管抽提

靜置

10000r／min離心10min加1/10加2倍放入離心移出水相NaAc無水乙醇

-20℃1-2h12000r／min離心15min加入超低溫冰箱融化、離心棄上清液

洗滌12000r／min離心15min干燥4℃

75%冷乙醇離心棄上清液加TE50μl存放DNA

*35核酸的沉淀原理：核酸與鈉、鉀、鎂形成的鹽在許多有機溶劑中不溶，也不會變性。醋酸鈉為沉淀DNA、RNA的最常用鹽類。有機溶劑：乙醇、異丙醇、聚乙二醇。溫度：冰水*36四、實驗步驟(ExperimentalProcedures)

等量分裝在兩支離心管內加入20ul的RNase加入等體積①提取液4℃10min酶解樣品待抽提的樣品抽提

靜置離心

配制TE緩沖液

加等體積②提取液500ul10000r／min離心10min4℃10min

移出水相至離心管抽提

靜置

10000r／min離心10min加1/10加2倍放入離心移出水相NaAc無水乙醇

-20℃1-2h12000r／min離心15min加入超低溫冰箱融化、離心棄上清液

洗滌12000r／min離心15min干燥4℃

75%冷乙醇離心棄上清液加TE50μl存放DNA

*37四、實驗步驟(ExperimentalProcedures)AgaroseGelElectrophoresis：Preparationofthegel

制備0.3％瓊脂糖凝膠LoadingDNAsamples