第六章-電泳技術(shù)2008

第六章核酸的電泳（electrophoresis）第一節(jié)、概述內(nèi)容：1、基本原理、裝置、影響因素和電泳種類。2、介紹瓊脂糖，聚丙烯酰胺凝膠電泳，還有脈沖場電泳、變性梯度凝膠電泳、雙向瓊脂糖凝膠電泳和凝膠滯后實(shí)驗(yàn)等。

1、電泳的基本原理

概念：帶電的膠?；虼蠓肿釉谕饧与妶鲋校驇喾措姾傻碾姌O作定向移動(dòng)的現(xiàn)象稱為電泳。

原理：分子的性質(zhì)：生物分子都帶電荷，其電荷的多少取決于分子性質(zhì)及其所在介質(zhì)的pH及其組成。電場性質(zhì)：在同一電場的作用下，電荷性質(zhì)、電荷數(shù)量以及分子量的不同的組分泳動(dòng)的方向和速度也各異。結(jié)果：在一定時(shí)間內(nèi)各組分移動(dòng)的距離不同，從而達(dá)到分離鑒定各組分的目的。電泳(electrophoresis)

/bioelectrochemistry

/tiselius.htm1948諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)

瑞典生化學(xué)家提塞留斯ArneTiselius(1937)電泳的遷移率在兩個(gè)平行電極上加一定的電壓（V），就會(huì)在電極中間產(chǎn)生電場強(qiáng)度（E）。L是電極間距離。

E=V/L電場對(duì)帶電分子的作用力（F），等于所帶凈電荷（q）與電場強(qiáng)度（E）的乘積：

F＝qE在移動(dòng)過程中，分子會(huì)受到介質(zhì)粘滯力的阻礙。粘滯力（F’）服從Stokes定律，即：

F’=6πrηυr是球狀分子的半徑，η是介質(zhì)粘度，υ是電泳速度電泳遷移率（u）公式當(dāng)帶電分子勻速移動(dòng)時(shí)：F=F’，∴q?E=6πrηυ。則電泳速度：υ=qE/6πrη電泳遷移率（u）是指在單位電場強(qiáng)度時(shí)帶電分子的遷移速度。也稱淌度：

u＝υ/E=q/6πrη

由上式可以看出，遷移率與帶電分子所帶凈電荷成正比，與分子的大小和緩沖液的粘度成反比。

2、電泳支持介質(zhì)最初的濾紙和醋酸纖維素膜

凝膠：淀粉凝膠，目前使用得最多的是瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠。介質(zhì)（有交聯(lián)孔徑），導(dǎo)致電泳技術(shù)不僅可以利用分子的電荷特性，而且還可以利用分子的大小來達(dá)到分離目的。聚丙烯酰胺凝膠電泳3、電泳的裝置水平電泳槽垂直電泳槽專利技術(shù)4、電泳的操作順序移液器、槍頭和分子量標(biāo)記電泳結(jié)果圖測序膠（大板膠）5、影晌電泳分離的主要因素

1.待分離生物大分子的性質(zhì)

2.緩沖液的性質(zhì)

3.電場強(qiáng)度

4.電滲

5.支持介質(zhì)的篩孔

影響因素1.

待分離大分子的性質(zhì)：所帶的電荷、分子大小和形狀，分子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形，則其電泳遷移速度越快2.緩沖液pH和離子強(qiáng)度：pH值距離其等電點(diǎn)愈遠(yuǎn)，其所帶凈電荷量就越大，電泳的速度也就越大；離子強(qiáng)度過低，則緩沖能力差，不易維持PH恒定，離子強(qiáng)度過高，在待分離分子周圍形成較強(qiáng)的帶相反電荷的離子擴(kuò)散層（即離子氛），降低了蛋白質(zhì)的帶電量，使電泳速度減慢。一般所用離子強(qiáng)度為0.02-0.2之間。3.電場強(qiáng)度：過高，產(chǎn)熱，樣品和Buffer擴(kuò)散增加，條帶增寬；蛋白變性。過低，電泳時(shí)間增加，擴(kuò)散。當(dāng)需要增大電場強(qiáng)度以縮短電泳時(shí)間時(shí)，需附有冷卻裝置。4.電滲：在電場中液體對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)（支持介質(zhì)表面可能會(huì)存在一些帶電基團(tuán)）；當(dāng)電滲方向與電泳方向一致時(shí)，會(huì)加快顆粒泳動(dòng)速度，反之，當(dāng)兩者方向相反時(shí)，會(huì)減慢顆粒泳動(dòng)速度。邊緣效應(yīng)，介質(zhì)厚度。5.支持介質(zhì)的篩孔：篩孔越小，則顆粒在移動(dòng)的過程中所受到的阻力也就越大。

6、電泳的分類

原理不同：⑴自由界面電泳：是在Ｕ形管中進(jìn)行電泳，無支持介質(zhì)。⑵區(qū)帶電泳：各組分分子在支持介質(zhì)中被分離成許多條明顯的區(qū)帶。⑶等速電泳：當(dāng)電泳達(dá)到平衡后，各電泳區(qū)帶相隨，并以等速向前運(yùn)動(dòng)，需使用專用電泳儀?！白陨硇Ｕ毙?yīng)。⑷

等電聚焦電泳：由兩性電解質(zhì)在電場中自動(dòng)形成pH梯度，當(dāng)被分離的生物大分子移動(dòng)到各自等電點(diǎn)的pH處聚集成很窄的區(qū)帶。

等速電泳先行離子（遷移率大）+樣品+終止離子（遷移率?。]有加入適當(dāng)?shù)闹С蛛娊赓|(zhì)來載帶電流，所得到的區(qū)帶是相互連接的。u1〉u2，υ1〉υ2，若u2跟不上u1，則形成一個(gè)離子稀薄區(qū)。電阻變大。I＝E/R，I恒定。則E變大。u＝υ/E，υ2變大，跟上u1。示意圖分類2按支持介質(zhì)的不同可分為：

⑴紙電泳（Paperelectrophorisis）

⑵醋酸纖維薄膜電泳（CelluloseAcetateelectrophoresis）

⑶瓊脂糖凝膠電泳（AgaroseGelelectrophoresis）⑷聚丙烯酰胺凝膠電泳（PolyacrylamideGelelectrophoresis）（PAGE）

⑸SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE）。按支持介質(zhì)形狀不同可分為：⑴薄層電泳；

⑵板電泳；

⑶柱電泳紙電泳示意圖醋酸纖維薄膜電泳SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS是一種陰離子去垢劑，SO32-帶負(fù)電荷。因此蛋白質(zhì)在含有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中與SDS分子結(jié)合時(shí)，可形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物。這種復(fù)合物由于結(jié)合大量帶負(fù)電荷的SDS，好比蛋白質(zhì)穿上帶負(fù)電的“外衣”，蛋白質(zhì)本身帶有的電荷則被掩蓋了。從而起到消除各蛋白質(zhì)分子之間自身的電荷差異的作用因此在電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移速度則主要取決于蛋白質(zhì)分子大小SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳示意圖分類2按用途不同可分為：⑴分析電泳；⑵制備電泳；⑶定量免疫電泳；⑷連續(xù)制備電泳。按所用電壓不同可分為：⑴低壓電泳：100V～500V，電泳時(shí)間較長，適于分離蛋白質(zhì)等生物大分子。⑵高壓電泳：1000V～5000V，電泳時(shí)間短，有時(shí)只需幾分鐘，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖類等小分子物質(zhì)的分離。核酸分析常用電泳瓊脂糖聚丙烯酰胺凝膠電泳脈沖場電泳變性梯度凝膠電泳、雙向瓊脂糖凝膠電泳和凝膠滯后實(shí)驗(yàn)等。不同核酸電泳方法的用途瓊脂糖凝膠分離DNA片段大小范圍較廣不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp至近50kb的DNA片段。聚丙烯酰胺凝膠電泳主要分離小片段DNA(5-500bp),其分辨力極高，甚至可分開相差1bp的DNA片段。

脈沖場凝膠電泳：分析超過1mb大片斷的DNA分子。變性梯度凝膠電泳：突變篩查。雙向電泳：分析重組分子和復(fù)制結(jié)構(gòu)。第二節(jié)瓊脂糖凝膠電泳天然瓊脂（agar）是一種多聚糖，主要由瓊脂糖（agarose，約占80%）及瓊脂膠（agarop-ectin）組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì)，不帶電荷，而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強(qiáng)酸性多糖，由于這些基團(tuán)帶有電荷，在電場作用下能產(chǎn)生較強(qiáng)的電滲現(xiàn)象，加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分離效果。因此，需要把瓊脂糖提取出來作為電泳支持物進(jìn)行平板電泳。

瓊脂糖的結(jié)構(gòu)瓊脂糖主要是由D－半乳糖和3,6脫水L－半乳糖連接而成的一種線性多糖。

瓊脂糖的交聯(lián)瓊脂糖之間以分子內(nèi)和分子間氫鍵形成較為穩(wěn)定的交聯(lián)結(jié)構(gòu)。瓊脂糖凝膠的孔徑可以通過瓊脂糖的最初濃度來控制，低濃度的瓊脂糖形成較大的孔徑，而高濃度的瓊脂糖形成較小的孔徑。瓊脂糖的純度盡管瓊脂糖本身沒有電荷，但一些糖基可能會(huì)被羧基、甲氧基特別是硫酸根不同程度的取代，使得瓊脂糖凝膠表面帶有一定的電荷，引起電泳過程中發(fā)生電滲以及樣品和凝膠間的靜電相互作用，影響分離效果。一次要控制瓊脂糖的提純純度。市售的瓊脂糖有不同的提純等級(jí)，主要以硫酸根的含量為指標(biāo)，硫酸根的含量越少，提純等級(jí)越高。瓊脂糖凝膠的制作將干的瓊脂糖懸浮于緩沖液中，加熱煮沸至溶液變?yōu)槌吻?，注入模板后室溫下冷卻凝聚即成瓊脂糖凝膠。

電泳的操作順序瓊脂糖電泳中DNA的分子機(jī)理通過熒光顯微鏡可以揭示DNA分子在電泳中的動(dòng)力學(xué)特性。DNA分子沿電場方向先伸展，后壓縮，然后形成緊密的球狀結(jié)構(gòu)。過渡狀態(tài)呈U型，是分子伸縮移動(dòng)的中間過程。

DNA在瓊脂糖中的移動(dòng)瓊脂糖電泳的優(yōu)點(diǎn)如下。（1）瓊脂糖凝膠電泳操作簡單，電泳速度快，樣品不需事先處理就可以進(jìn)行電泳。（2）瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻，含水量大（約占98%~99%），近似自由電泳，樣品擴(kuò)散較自由，電流對(duì)樣品吸附極微，因此電泳圖譜清晰，分辨率高，重復(fù)性好。（3）瓊脂糖透明無紫外吸收，電泳過程和結(jié)果可直接用紫外光燈檢測及定量測定。（4）電泳后區(qū)帶易染色，樣品極易洗脫，便于定量測定。制成干膜可長期保存。影響瓊脂糖凝膠DNA遷移率的因素

DNA的大小構(gòu)型電壓溫度緩沖液1、DNA的大小與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系DNA分子的大小

在凝膠中，DNA片段遷移距離（遷移率）與堿基對(duì)的對(duì)數(shù)成反比。DNA分子大小超過20kb時(shí)，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開。此時(shí)電泳的遷移率不再依賴于分子大小。DNA的大小對(duì)應(yīng)的凝膠中瓊脂糖的百分含量。瓊脂糖凝膠濃度％線性DNA的有效分離范圍／kb0.35—600.61—20O.70.8—10O.90.5—71.20.4—61.50.2—42.00.1—32、核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系不同構(gòu)型DNA的移動(dòng)速度次序?yàn)椋洪]環(huán)DNA(covalelltlyclosedcircularDNA，簡稱cccDNA)>直線DNA(linearDNA，簡稱LDNA)>開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA(一條鏈斷裂opencircularDNA，簡稱ocDNA)

。與瓊脂糖濃度也有關(guān)系。

3、電壓在低電壓時(shí)，線狀DNA片斷的遷移速度與所加電壓成正比。但高分子量DNA片斷的遷移率將隨場強(qiáng)的增加而不同程度的增加，導(dǎo)致瓊脂糖凝膠的有效分離范圍縮小。對(duì)于大于2kb的片斷，電壓不應(yīng)該超過5V/cm。4、溫度4-30℃之間，DNA片段的遷移率不發(fā)生改變。但濃度低的瓊脂糖凝膠和低熔點(diǎn)凝膠較為脆弱，最好在4℃下電泳，使其強(qiáng)度增大。5、電泳緩沖液TAE（Tris-醋酸），TBE（Tris-硼酸），TPE(Tris-磷酸)三種。使用濃度大約都在0.05M左右。都含有大約0.001M的EDTA。TAE的緩沖容量低，長時(shí)間電泳會(huì)使得緩沖容量喪失。另外兩種成本高，但緩沖容量高。雙鏈線狀DNA在TAE中的泳動(dòng)速度比其他兩種快10%，超螺旋DNA在TAE中的分辨率也較高。瓊脂糖電泳分離的DNA的回收1、DEAE(二乙基氨基乙醇)-纖維素膜電泳回收法：在目的DNA前方切一條裂隙，將一長條DEAE-纖維素膜插入到裂隙中，繼續(xù)電泳直條中所有DNA轉(zhuǎn)移到DEAE-纖維素膜上。2、透析袋：把目的條帶切下來放到透析袋中，電泳直至膠條中的DNA分子泳動(dòng)到緩沖液中。3、從低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中回收DNA：就是在瓊脂糖得多糖鏈上引入羥乙基，使得瓊脂糖的熔點(diǎn)降到65℃，然后用酚抽提除去瓊脂糖,達(dá)到分離DNA的目的。第三節(jié)聚丙烯酰胺電泳（PAGE）聚丙烯酰胺凝膠電泳簡稱為PAGE（Polyacrylamidegelelectrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠是由單體的丙烯酰胺（CH2=CHCONH2；

Acrylamide）甲叉雙丙烯酰胺（CH2(NHCOHC=CH2)；2N,N’-methylenebisacrylamide）

聚合而成。

1、聚合原理：

催化劑是過硫酸銨（AP）以及加速劑四甲基乙二胺（TEMED）。乙烯基“CH2=CH－”一個(gè)接一個(gè)的聚合作用就形成丙烯酰胺長鏈，同時(shí)甲叉雙丙烯酰胺在不斷延長的丙烯酰胺鏈間形成甲叉鍵交聯(lián)，從而形成交聯(lián)的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。

聚丙烯酰胺凝膠的分子結(jié)構(gòu)形成凝膠的反應(yīng)過程2、聚丙烯酰胺凝膠的孔徑的控制通過改變丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的濃度來控制，丙烯酰胺的濃度可以在3％－30％之間：低濃度的凝膠具有較大的孔徑。高濃度凝膠具有較小的孔徑，對(duì)生物大分子有分子篩的效應(yīng)，如10％－20％的凝膠常用于SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離膠。DNA在聚丙烯酰胺凝膠中的有效分離范圍丙烯酰胺濃度<%(w/v)>有效分離范圍（bp）3.5100-10005.080-5008.060-40012100凝膠濃度的計(jì)算聚合后的聚丙烯酰胺凝膠的強(qiáng)度、彈性、透明度、粘度和孔徑大小均取決于兩個(gè)重要參數(shù)T和C，T是丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺兩個(gè)單體的總百分濃度。C是與T有關(guān)的交聯(lián)百分濃度。T與C的計(jì)算公式是：上式中a為丙烯酰胺的克數(shù)，b為甲叉雙丙烯酰胺的克數(shù)，m為水或緩沖液體積（ml）。式中a與b的比例很重要。富有彈性，且完全透明的凝膠，a與b的重量比應(yīng)在30左右。）選擇T和C的經(jīng)驗(yàn)公式

C=6.5－0.3T當(dāng)C保持恒定時(shí)，凝膠的有效孔徑隨著T的增加而減小.當(dāng)T保持恒定，C為4％時(shí)，有效孔徑最小，C大于或小于4％時(shí)，有效孔徑均變大。C大于5％時(shí)凝膠變脆，不宜使用，實(shí)驗(yàn)中最常用的C是2.6％和3％。3、貯存配成30％的丙烯酰胺水溶液在4℃下能保存1個(gè)月，在貯存期間丙烯酰胺會(huì)水解為丙烯酸而增加電泳時(shí)的電滲現(xiàn)象并減慢電泳的遷移率。丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是一種對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有毒的試劑，操作時(shí)要避免直接接觸皮膚，但它們聚合后則無毒。4、聚丙烯酰胺電泳的優(yōu)點(diǎn)其主要的優(yōu)點(diǎn)有：①可以控制膠濃度“T”和交聯(lián)度“C”，從而得到不同的有效孔徑，用于分離不同分子量的生物大分子。②能把分子篩作用和電荷效應(yīng)結(jié)合在同一方法中，達(dá)到更高的靈敏度。③由于聚丙烯酰胺凝膠是由－C－C－鍵結(jié)合的酰胺多聚物，側(cè)鏈只有不活潑的酰胺基－CO－NH2，沒有帶電的其他離子基團(tuán)，化學(xué)惰性好，電泳時(shí)不會(huì)產(chǎn)生“電滲”。聚丙烯酰胺電泳的優(yōu)點(diǎn)④由于可以制得高純度的單體原料，因而電泳分離的重復(fù)性好。⑤透明度好，便于照相和復(fù)印。機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，不易碎，便于操作和保存。⑥無紫外吸收，不染色就可以用于紫外波長的凝膠掃描作定量分析。⑦還可以用作固定化酶的惰性載體。

與瓊脂糖凝膠相比：1、分辨力強(qiáng)?？煞值?bp。2、裝載的DNA量大。一個(gè)樣品槽可以裝10ugDNA。3、回收的純度高。5、聚丙烯酰胺凝膠的分類柱狀電泳

垂直平板電泳

水平平板電泳

6、聚丙烯酰胺凝膠的操作比瓊脂糖凝膠電泳復(fù)雜：1、凝膠總是夾在兩塊玻璃之間，需要排氣泡。2、每塊玻璃都要進(jìn)行烷硅化處理，防止電泳完畢后從膠模中取出凝膠發(fā)生破裂。

操作與結(jié)果第四節(jié)其它電泳方法脈沖場凝膠電泳雙向瓊脂糖凝膠電泳變性梯度凝膠電泳凝膠滯后實(shí)驗(yàn)脈沖場凝膠電泳PulsedFieldGelElectrophoresis，PFGE應(yīng)用范圍：雙鏈DNA分子長度超過20kb，他們的電泳遷移率就會(huì)相同（極限遷移率）。低瓊脂糖濃度的瓊脂糖凝膠（0.1%～0.2%），對(duì)于分離較大的核酸分子片斷比較有用。這是因?yàn)樗麄冇忠粋€(gè)較高的分離極限（750kb），但這種膠很脆，容易折斷，操作起來也非常耗時(shí)。脈沖場凝膠電泳原理DNA分子沿電場方向先伸展，后壓縮，然后形成緊密的球狀結(jié)構(gòu)。過渡狀態(tài)呈U型，是分子伸縮移動(dòng)的中間過程。一旦這種構(gòu)象改變過程發(fā)生，DNA分子電泳的遷移率就會(huì)發(fā)生劇烈的變化。由于DNA分子構(gòu)象轉(zhuǎn)變所需的時(shí)間長短與DNA分子的長度成正比。DNA在瓊脂糖中的移動(dòng)脈沖電泳結(jié)果大分子：來不及調(diào)整自己的構(gòu)型，仍然保持球形。前進(jìn)。?。和鶑?fù)運(yùn)動(dòng)或進(jìn)二退一。做無用功。大分子DNA在他停止之前在凝膠上泳動(dòng)會(huì)更遠(yuǎn)，導(dǎo)致分子大小分離。類型正交交變電場凝膠電泳（OFAG)鉗形均勻電場電泳（CHEF）旋轉(zhuǎn)電泳倒轉(zhuǎn)場電泳（FIGE）各種類型的脈沖電泳倒轉(zhuǎn)場凝膠電泳（FIGE）

可以把10-2000kb的DNA片斷分開。不同電場方向有不同脈沖方式（周期長短不同）的電場分離分子。在一個(gè)脈沖周期中，小的分子可以數(shù)次完成中間體的形成與脫開過程，一次在較長的脈沖方向上獲得凈速度。大分子在反方向短的脈沖周期中，沒有足夠的時(shí)間回縮，只能在長周期中泳動(dòng)。而中等程度的分子在每一周期中都可泳動(dòng)，發(fā)生往復(fù)運(yùn)動(dòng)因此總的泳動(dòng)速度最慢。

fieldinversiongelelectrophoresis(FIGE)PFGEseparationof0.5μgofLambdaMonoCutMix.1%agarosegel,0.5XTBE,6V/cm,15°Cfor20hours.Switchtimesrampedfrom0.5-1.5seconds.雙向瓊脂糖凝膠電泳（2-Dgel)DNA分子形狀各異，不僅有線狀的，而且還有一些非線狀的，如帶有復(fù)制叉和重組DNA結(jié)構(gòu)。類型：中性/中性，中性/堿性中性/中性雙向瓊脂糖凝膠電泳：非線狀的泳動(dòng)行為是不規(guī)則的。這種不規(guī)則隨著電壓和瓊脂糖濃度增加而加劇。原理：在第一向中，樣品在瓊脂糖凝膠中以低電壓和低瓊脂糖濃度的條件進(jìn)行電泳，則DNA分子主要根據(jù)其分子量大小而分離。在第二向中，則采用高濃度的瓊脂糖和高電壓，DNA分子則主要根據(jù)其形狀而被分離。二維電泳雙向瓊脂糖凝膠電泳中性/堿性瓊脂糖凝膠電泳：復(fù)制中間體。這些中間體包括各種長度的新鏈部分。在第一向中，樣品在瓊脂糖凝膠中以低電壓和低瓊脂糖濃度的條件進(jìn)行電泳，則DNA分子主要根據(jù)其分子量大小而分離。在第二向中，采用堿性條件，使得DNA分子復(fù)制中間體中新鏈與摸板分開，在電壓條件下按照長度的不同而得到分離（分別得到新鏈和模版）。變性梯度凝膠電泳（denaturedgradientgelelectrophoresis，DGGE）最初是Lerman等人于20世紀(jì)80年代初期發(fā)明的，起初主要用來檢測DNA片段中的點(diǎn)突變。Muyzer等人在1993年首次將其應(yīng)用于微生物群落結(jié)構(gòu)研究

。后來又發(fā)展出其衍生技術(shù)，溫度梯度凝膠電泳（temperaturegradientgelelectrophoresis，TGGE）。是診斷遺傳疾病的重要方法，也是研