微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用 (2課時(shí))

微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用(2課時(shí))

微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用考點(diǎn)1.微生物的分離與培養(yǎng)2.測(cè)定某種微生物的數(shù)量3.研究培養(yǎng)基對(duì)微生物的選擇作用4.探討微生物的利用主要技術(shù)：1.培養(yǎng)基的制備2.高壓蒸汽滅菌和干熱滅菌3.倒平板操作4.平板劃線(xiàn)操作和稀釋涂布平板法5.應(yīng)用選擇培養(yǎng)基分離某種特定的微生物微生物包括哪五類(lèi)：病毒細(xì)菌放線(xiàn)菌真菌原生動(dòng)物特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)都相當(dāng)簡(jiǎn)單,個(gè)體多數(shù)十分微小.通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu).原核生物界原生生物界真菌界病毒界微生物基礎(chǔ)知識(shí)歸納：自養(yǎng)型生物有什么共同特點(diǎn)？營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是指維持機(jī)體生命活動(dòng)，保證發(fā)育、生殖所需的外源物質(zhì)。人及動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：水、無(wú)機(jī)鹽、糖類(lèi)、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、維生素六類(lèi)。植物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：礦質(zhì)元素、水、二氧化碳等三類(lèi)。微生物的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)：水、無(wú)機(jī)鹽、碳源、氮源及特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)五類(lèi)。什么是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)？選擇培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基:

分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:

分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無(wú)氮培養(yǎng)基:

分離固氮菌不加含碳有機(jī)物的無(wú)碳培養(yǎng)基:

分離自養(yǎng)型微生物加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基:

分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞加入氨基喋呤、次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基:分離雜交瘤細(xì)胞4.無(wú)菌技術(shù)消毒方法：（1）日常生活經(jīng)常用到的是

消毒法；（2）對(duì)一些不耐高溫的液體，則使用

消毒法（3）對(duì)接種室、接種箱或超凈工作臺(tái)首先噴灑

等溶液以增強(qiáng)消毒效果，然后使用

進(jìn)行物理消毒。（4）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手使用

進(jìn)行消毒；（5）飲水水源用

進(jìn)行消毒。煮沸巴氏石炭酸或煤酚皂紫外線(xiàn)酒精氯氣滅菌方法：（1）接種環(huán)、接種針、試管口等使

滅菌法；（2）玻璃器皿、金屬用具等使用

法，所用器械是

；（3）培養(yǎng)基、無(wú)菌水等使用

滅菌法，所用器械是

。（4）表面滅菌和空氣滅菌等使用

滅菌法，所用器械是

。灼燒干熱滅菌箱干熱滅菌高壓蒸汽高壓蒸汽滅菌鍋?zhàn)贤饩€(xiàn)紫外燈小結(jié)：微生物實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的基本操作程序1、器具的滅菌2、培養(yǎng)基的配制3、培養(yǎng)基的滅菌4、倒平板5、微生物接種6、恒溫箱中培養(yǎng)7、菌種的保存5.菌種的保存①臨時(shí)保藏方法將菌種接種到試管的固體斜面培養(yǎng)基上，在合適的溫度下培養(yǎng)。當(dāng)菌落長(zhǎng)成后，將試管放入4℃的冰箱中保藏。以后每3～6個(gè)月，都要重新將菌種從舊的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基上。②長(zhǎng)期保存的菌種，可以采用甘油管藏的方法。-20℃下保存1.（09遼寧、寧夏卷）（1）在大腸桿菌培養(yǎng)過(guò)程中，除考慮營(yíng)養(yǎng)條件外，還要考慮______、______和滲透壓等條件。由于該細(xì)菌具有體積小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、變異類(lèi)型容易選擇、______、_____________等優(yōu)點(diǎn)，因此常作為遺傳學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)材料。（2）在微生物培養(yǎng)操作過(guò)程中，為防止雜菌污染，需對(duì)培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿進(jìn)行________（消毒、滅菌）；操作者的雙手需要進(jìn)行清洗和______；靜止空氣中的細(xì)菌可用紫外線(xiàn)殺滅，其原因是紫外線(xiàn)能使蛋白質(zhì)變性，還能_____________________。

溫度酸堿度易培養(yǎng)生活周期短滅菌消毒損傷DNA的結(jié)構(gòu)

（3）若用稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)大腸桿菌活菌的個(gè)數(shù)，要想使所得估計(jì)值更接近實(shí)際值，除應(yīng)嚴(yán)格操作、多次重復(fù)外，還應(yīng)保證待測(cè)樣品稀釋的_______。（4）通常，對(duì)獲得的純菌種還可以依據(jù)菌落的形狀、大小等菌落特征對(duì)細(xì)菌進(jìn)行初步的____________。比例合適鑒定(或分類(lèi))（5）培養(yǎng)大腸桿菌時(shí)，在接種前需要檢測(cè)培養(yǎng)基是否被污染。對(duì)于固體培養(yǎng)基應(yīng)采用的檢測(cè)方法是__________________________________________________________________________________。（6）若用大腸桿菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用過(guò)的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)物必須經(jīng)過(guò)_______處理后才能丟棄，以防止培養(yǎng)物的擴(kuò)散。將未接種的培養(yǎng)基(接種無(wú)菌水）在適宜的溫度下放置適宜的時(shí)間，觀(guān)察培養(yǎng)基上是否有菌落產(chǎn)生.滅菌測(cè)定微生物數(shù)量的方法：1)直接計(jì)數(shù)法：最常用的顯微鏡直接計(jì)數(shù)。優(yōu)點(diǎn)：設(shè)備簡(jiǎn)單、能觀(guān)察微生物的形態(tài)特征。缺點(diǎn)：不能區(qū)分死菌和活菌；難以計(jì)數(shù)微小的細(xì)菌。一般用于純培養(yǎng)懸浮液中各種單細(xì)胞菌體的計(jì)數(shù)。6.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目

2）間接計(jì)數(shù)法：

最常用稀釋涂布平板計(jì)數(shù)法

應(yīng)用：統(tǒng)計(jì)樣品中活菌的數(shù)目

①原理：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落，來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌，通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌。

（注意）：一般選擇菌落數(shù)在30-300的平板進(jìn)行記數(shù)。②操作：

a、設(shè)置重復(fù)組：增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說(shuō)服力和準(zhǔn)確性。

空白對(duì)照：

指不做任何實(shí)驗(yàn)處理的對(duì)象組。對(duì)照的種類(lèi)自身對(duì)照：指實(shí)驗(yàn)與對(duì)照在同一對(duì)象上進(jìn)行，即不另設(shè)對(duì)照組。如“植物細(xì)胞質(zhì)壁分離和復(fù)原”實(shí)驗(yàn)，就是典型的自身對(duì)照。自身對(duì)照，方法簡(jiǎn)便，關(guān)鍵是要看清楚實(shí)驗(yàn)處理前后現(xiàn)象變化的差異，實(shí)驗(yàn)處理前的對(duì)象狀況為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)處理后的對(duì)象變化則為實(shí)驗(yàn)組。

條件對(duì)照：指雖給對(duì)象施以某種實(shí)驗(yàn)處理，但這種處理是作為對(duì)照意義的，或者說(shuō)這種處理不是實(shí)驗(yàn)假設(shè)所給定的實(shí)驗(yàn)變量意義的。例如，“動(dòng)物激素飼喂小動(dòng)物”實(shí)驗(yàn)，采用等組實(shí)驗(yàn)法，其實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案是：

甲組：飼喂甲狀腺激素（實(shí)驗(yàn)組）；

乙組：飼喂甲狀腺抑制劑（條件對(duì)照組）；

丙組：不飼喂藥劑（空白對(duì)照組）。

相互對(duì)照：指不另設(shè)對(duì)照組，而是幾個(gè)實(shí)驗(yàn)組相互對(duì)比對(duì)照.如：探究溫度對(duì)酶活性的影響b、對(duì)照原則：判斷培養(yǎng)基中是否有雜菌污染，將未接種的培養(yǎng)基同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)。判斷選擇培養(yǎng)基是否具有篩選作用，對(duì)照培養(yǎng)基接種后培養(yǎng)觀(guān)察菌落數(shù)目。計(jì)算公式：每克樣品中的菌株數(shù)=（C/V）ⅹM2.1升水中大腸桿菌不得超過(guò)3個(gè)，即大腸桿菌指數(shù)不得大于3。某人在測(cè)定自來(lái)水中的大腸桿菌群時(shí)，先將5升自來(lái)水水樣濃縮至5毫升，然后各取濃縮水樣1毫升，涂布到4個(gè)培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，4次培養(yǎng)后計(jì)數(shù)的菌落數(shù)分別是32、38、35、8。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：(1)根據(jù)上述結(jié)果計(jì)算，被檢水樣大腸桿菌指數(shù)為

，水樣

(是、否)達(dá)標(biāo)。

35否微生物的分離（一）篩選菌株自然界篩選：根據(jù)它對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。(如耐高溫的TaqDNA聚合酶)實(shí)驗(yàn)室篩選：人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件（包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH等），同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。

一、研究思路選擇培養(yǎng)基：

在微生物學(xué)中，將允許特定種類(lèi)的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種類(lèi)微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。目的是從眾多微生物中分離所需要的微生物。1.原理：尿素是一種重要的農(nóng)業(yè)氮肥，只有當(dāng)土壤中的細(xì)菌將尿素分解成氨之后，才能被植物利用。尿素細(xì)菌能合成脲酶，在脲酶的作用下尿素被分解成氨。

CO(NH2)2+H2OCO2+2NH3二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)脲酶實(shí)驗(yàn)方案分離篩選微生物的原理有利于目的菌株生長(zhǎng)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)人為條件微生物計(jì)數(shù)方法與原理稀釋涂布平板法顯微鏡直接計(jì)數(shù)法對(duì)照設(shè)置與重復(fù)設(shè)置實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)操作結(jié)果與分析土壤中尿素分解菌的分離與計(jì)數(shù)（2）實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的內(nèi)容包括實(shí)驗(yàn)方案、材料用具、實(shí)施步驟和時(shí)間安排等。（3）實(shí)驗(yàn)流程：

土壤取樣

樣品系列稀釋

涂布平板與培養(yǎng)

觀(guān)察并記錄結(jié)果

菌落計(jì)數(shù)

閱讀思考3、土壤微生物主要分布在距地表

的近

土壤中，約

為細(xì)菌。4、分離不同的微生物采用不同的，其原因是

，其目的是保證獲得

的平板。細(xì)菌稀釋度為

，放線(xiàn)菌稀釋度為

，真菌稀釋度為

。3～8cm中性70％～80％不同微生物在土壤中含量不同菌落數(shù)在30～300之間、適于計(jì)數(shù)104、105、106103、104、105102、103、104稀釋度5、培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。細(xì)菌一般在

℃培養(yǎng)1～2d，放線(xiàn)菌一般在

℃培養(yǎng)5～7d，霉菌一般在

℃的溫度下培養(yǎng)3～4d。6、在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔

h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。選取

時(shí)的記錄作為結(jié)果，以防止因

而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。

7、菌落的特征包括

等方面。30～3725～2825～2824菌落數(shù)目穩(wěn)定培養(yǎng)時(shí)間不足形狀、大小、隆起程度、顏色（1）對(duì)分離的菌種作進(jìn)一步的鑒定，還需要借助

的方法。(2)在細(xì)菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)中，細(xì)菌合成的

將尿素分解成了

。氨會(huì)使培養(yǎng)基的堿性

，pH

。因此，我們可以通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)基

變化來(lái)判斷該化學(xué)反應(yīng)是否發(fā)生。(3)在以

為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入

指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果pH升高，指示劑將變

，說(shuō)明該細(xì)菌能夠

。

三、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)生物化學(xué)脲酶氨增強(qiáng)升高pH尿素酚紅紅分解尿素

測(cè)定飲水中大腸桿菌數(shù)量的方法是將一定體積的水用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾后，將濾膜放到

培養(yǎng)基上培養(yǎng)，大腸桿菌菌落呈現(xiàn)

色，通過(guò)記數(shù)得出水樣中大腸桿菌的數(shù)量。該實(shí)驗(yàn)中至少應(yīng)取

個(gè)水樣。三、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)伊紅美藍(lán)深紫三8.（09安徽卷）下列是關(guān)于“檢測(cè)土壤中細(xì)菌總數(shù)”實(shí)驗(yàn)操作的敘述，其中錯(cuò)誤的是A.用蒸餾水配制牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，經(jīng)高溫、高壓滅菌后倒平板B.取104、105、106倍的土壤稀釋液和無(wú)菌水各0.1ml，分別涂布于各組平板上C.將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組平板倒置，370C恒溫培養(yǎng)24-48小時(shí)D.確定對(duì)照組無(wú)菌后，選擇菌落數(shù)在300以上的實(shí)驗(yàn)組平板進(jìn)行計(jì)數(shù)D9.(09上海)（9分）氯苯化合物是重要的有機(jī)化工原料，原因不易降解，會(huì)污染環(huán)境。某研究小組依照下列實(shí)驗(yàn)方案（圖1）篩選出能高效降解氯苯的微生物SP1菌，培養(yǎng)基配方如表1（1）配制Ⅱ號(hào)固體培養(yǎng)基時(shí)，除添加Ⅱ號(hào)液體培養(yǎng)基成分外，還應(yīng)添加1%的_______。（2）培養(yǎng)基配制時(shí)，滅菌與調(diào)PH的先后順序是

。（3）從用途上來(lái)說(shuō)，Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基和Ⅱ號(hào)培養(yǎng)基分別屬于_____培養(yǎng)基和______培養(yǎng)基。在Ⅱ號(hào)培養(yǎng)基中，為SP1菌提供氮源的成分是_______。（4）在營(yíng)養(yǎng)缺乏或環(huán)境惡劣時(shí)，SP1的菌體會(huì)變成一個(gè)圓形的休眠體，這種休眠體被稱(chēng)為_(kāi)________。

瓊脂先調(diào)pH，后滅菌普通選擇硝酸銨芽孢

（4）將SP1菌接種在含不同濃度氯苯的Ⅲ號(hào)培養(yǎng)液中培養(yǎng)，得到生長(zhǎng)曲線(xiàn)（如圖2）。從圖2可知SP1菌在____________培養(yǎng)條件下最早停止生長(zhǎng)，其原因是____________。20mg/L氯苯氯苯最早耗盡10.(09湛江一模)生物乙醇是以生物為原料生產(chǎn)的可再生能源。我國(guó)利用農(nóng)作物廢棄物(秸稈)生產(chǎn)乙醇，其技術(shù)流程為：纖維素酶解→酵母發(fā)酵→蒸餾→成品。(1)纖維素酶的成本能否下降，是能否實(shí)現(xiàn)乙醇工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵因素。纖維素酶可以從能分解纖維素的細(xì)菌培養(yǎng)液中提取。某同學(xué)設(shè)計(jì)了如下分離土壤中纖維素分解菌的實(shí)驗(yàn)流程：土壤取樣--選擇培養(yǎng)--梯度稀釋--鑒別培養(yǎng)。①最好選擇怎樣的環(huán)境采集土樣?

選擇纖維素豐富的土壤環(huán)境

②以下是一種培養(yǎng)基配方：纖維素粉5g、NaN031g、Na2HP04·7H201.2g、KH2P04O.9g、MgS04·7H20O.5g、KCl0.5g、酵母膏0.5g、水解酵素0.5g(蒸餾水定容到1.0mL)。該培養(yǎng)基能夠增加樣品中纖維素分解菌的濃度，其原理是

。培養(yǎng)基中纖維素是主要碳源，有利于纖維素分解菌生長(zhǎng)，同時(shí)抑制其他微生物生長(zhǎng)③為了鑒別纖維素分解菌和進(jìn)一步純化菌種，可以在鑒別培養(yǎng)基中加入

染液，將篩選獲得的菌液稀釋后用

法接種到鑒別培養(yǎng)基上，然后挑選產(chǎn)生

的菌落作為菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。④纖維素分解菌培養(yǎng)液