GB 4789.28-2024 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求

中 華 人 民 共 和 國(guó) 國(guó) 家 標(biāo) 準(zhǔn)B4食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求8發(fā)布 8實(shí)施中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)國(guó) 家 市 場(chǎng) 監(jiān) 督 管 理 總 局 發(fā)布B4目 次前言 Ⅲ范圍 1術(shù)語和定義 1質(zhì)量控制 1培養(yǎng)基和試劑的批次培養(yǎng)基和試劑的性能

………………1………………1培養(yǎng)基 1液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基

…………………………1…………………………1半固體培養(yǎng)基 1運(yùn)輸培養(yǎng)基保藏培養(yǎng)基

…………………………1…………………………2懸浮培養(yǎng)基 2復(fù)蘇培養(yǎng)基 2增菌培養(yǎng)基 2選擇性增菌培養(yǎng)基 2非選擇性增菌培養(yǎng)基 2分離培養(yǎng)基 2選擇性分離培養(yǎng)基 2非選擇性分離培養(yǎng)基 2鑒別培養(yǎng)基特異性培養(yǎng)基2鑒定培養(yǎng)基 2計(jì)數(shù)培養(yǎng)基 2參比培養(yǎng)基 3商品化即用型培養(yǎng)基 3商品化脫水合成培養(yǎng)基 3自制培養(yǎng)基 3試劑 3測(cè)試菌株 3標(biāo)準(zhǔn)菌株 3標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株 3儲(chǔ)備菌株 3工作菌株 3ⅠB4培養(yǎng)基及試劑質(zhì)量保證 4證明文件 4

…………………4培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)室制備 5培養(yǎng)基的使用培養(yǎng)基的棄置

………………………6………………………6測(cè)試菌株的保藏及使用 6一般要求 6商業(yè)來源的測(cè)試菌株 6實(shí)驗(yàn)室制備的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株 7儲(chǔ)備菌株工作菌株

……………7……………7培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求 7基本要求 7微生物學(xué)要求 8培養(yǎng)基和試劑性能測(cè)試方法 8非選擇性分離和計(jì)數(shù)固體培養(yǎng)基目標(biāo)菌生長(zhǎng)率定量測(cè)試方法 8選擇性分離和計(jì)數(shù)固體培養(yǎng)基測(cè)試方法 9非選擇性增菌培養(yǎng)基半定量測(cè)試方法 0選擇性增菌培養(yǎng)基半定量測(cè)試方法 1選擇性液體計(jì)數(shù)培養(yǎng)基半定量測(cè)試方法 2懸浮培養(yǎng)基和運(yùn)輸培養(yǎng)基定量測(cè)試方法 2鑒定培養(yǎng)基測(cè)試方法 3實(shí)驗(yàn)試劑測(cè)試方法 4附錄A培養(yǎng)基性能測(cè)試方法流程圖 5附錄B培養(yǎng)基不正確配制出現(xiàn)的質(zhì)量問題及原因分析 9附錄C標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株和工作菌株制備 0附錄D食品安全微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中指定的培養(yǎng)基成分 2附錄E食品安全微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中參比培養(yǎng)基的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn) 3附錄F食品微生物實(shí)驗(yàn)室使用培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn) 8附錄G測(cè)試菌株 6附錄H 螺旋平板法 9ⅡB4前 言本標(biāo)準(zhǔn)代替食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)要求。本標(biāo)準(zhǔn)與3相比主要變化如下:增加了附錄E參比培養(yǎng)基的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)及質(zhì)控菌株一覽表;增加了培養(yǎng)基性能測(cè)試方法流程圖;增加了附錄G測(cè)試菌株中文名拉丁名及編號(hào)一覽表;刪除了純化學(xué)培養(yǎng)基未定義和部分定義的化學(xué)培養(yǎng)基確證培養(yǎng)基;修改了部分測(cè)試菌株;修改了生產(chǎn)商和實(shí)驗(yàn)室使用商品化培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)方法;修改了附錄F的菌株編號(hào)和名稱。ⅢB4食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品微生物學(xué)檢驗(yàn)用培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品微生物學(xué)檢驗(yàn)用培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量控制。術(shù)語和定義質(zhì)量控制為滿足質(zhì)量要求所采取的技術(shù)操作和活動(dòng)。培養(yǎng)基和試劑的批次這些產(chǎn)品批號(hào)相同。培養(yǎng)基和試劑完整的可追溯單位是指在特定的生產(chǎn)周期生產(chǎn)這些產(chǎn)品批號(hào)相同。品,品培養(yǎng)基和試劑的性能在一定條件下培養(yǎng)基和試劑對(duì)測(cè)試菌株的反應(yīng)。培養(yǎng)基液體半固體或固體形式的含天然或合成成分用于保證微生物繁殖鑒定或保持其活力的物質(zhì)。液體培養(yǎng)基由含有一種或多種成分的水溶液組成的培養(yǎng)基如緩沖蛋白胨水。固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基中加入一定量固化物如瓊脂經(jīng)煮沸或濕熱滅菌處理冷卻至室溫后凝固成固體狀態(tài)的培養(yǎng)基。傾注到平皿內(nèi)的固體培養(yǎng)基一般稱作通常稱作斜面。半固體培養(yǎng)基

倒入試管并傾斜擺放的固體培養(yǎng)基

當(dāng)培養(yǎng)基凝固后在液體培養(yǎng)基中加入少量固化物如瓊脂經(jīng)煮沸或濕熱滅菌處理冷卻后成半固體狀態(tài)的培養(yǎng)基。運(yùn)輸培養(yǎng)基在取樣后至實(shí)驗(yàn)室處理前保護(hù)和維持微生物活性且不允許微生物明顯增殖或減少的培養(yǎng)基。運(yùn)輸培養(yǎng)基中通常不含使微生物增殖的物質(zhì)但是培養(yǎng)基應(yīng)能保護(hù)菌株如緩沖甘油氯化鈉溶液1B4運(yùn)輸培養(yǎng)基。保藏培養(yǎng)基用于在一定期限內(nèi)保護(hù)和維持微生物活力防止長(zhǎng)期保存對(duì)其不利的影響或使其在長(zhǎng)期保存后容易復(fù)蘇的培養(yǎng)基如營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面。懸浮培養(yǎng)基將測(cè)試樣品的微生物分散到液相中在整個(gè)接觸過程中不產(chǎn)生增殖或抑制作用的培養(yǎng)基如磷酸鹽緩沖液。復(fù)蘇培養(yǎng)基能夠使受損或應(yīng)激的微生物修復(fù)使微生物恢復(fù)正常生長(zhǎng)能力但不一定促進(jìn)微生物繁殖的培養(yǎng)基如胰蛋白胨大豆肉湯。增菌培養(yǎng)基通常為液體培養(yǎng)基能夠給微生物繁殖提供特定的生長(zhǎng)環(huán)境。選擇性增菌培養(yǎng)基能夠允許特定的微生物在其中繁殖而部分或全部抑制其他微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基如B培養(yǎng)基。非選擇性增菌培養(yǎng)基能夠保證多種微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基如營(yíng)養(yǎng)肉湯。分離培養(yǎng)基支持微生物生長(zhǎng)的固體或半固體培養(yǎng)基。選擇性分離培養(yǎng)基支持特定微生物生長(zhǎng)而抑制其他微生物生長(zhǎng)的固體培養(yǎng)基如D瓊脂。非選擇性分離培養(yǎng)基對(duì)微生物沒有選擇性抑制的固體培養(yǎng)基如營(yíng)養(yǎng)瓊脂。鑒別培養(yǎng)基特異性培養(yǎng)基)能夠進(jìn)行一項(xiàng)或多項(xiàng)微生物生理和或生化特性鑒定的培養(yǎng)基如伊紅美藍(lán)瓊脂。注能夠用于分離培養(yǎng)的鑒別培養(yǎng)基被稱作分離鑒別培養(yǎng)基如D瓊脂。鑒定培養(yǎng)基能夠產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)特定的鑒定反應(yīng)而通常不需要進(jìn)一步確證試驗(yàn)的培養(yǎng)基如乳糖發(fā)酵管。注用于分離的鑒定培養(yǎng)基被稱為分離鑒定培養(yǎng)基。計(jì)數(shù)培養(yǎng)基能夠?qū)ξ⑸镞M(jìn)行定量計(jì)數(shù)的選擇性如P瓊脂或非選擇性培養(yǎng)基如平板計(jì)數(shù)瓊脂。注計(jì)數(shù)培養(yǎng)基可包含復(fù)蘇和或增菌培養(yǎng)基的特性。2B4參比培養(yǎng)基依據(jù)培養(yǎng)基配方特別制備質(zhì)量?jī)?yōu)良的培養(yǎng)基用于培養(yǎng)基的質(zhì)量控制以保證食品微生物檢驗(yàn)用培養(yǎng)基的質(zhì)量。參比培養(yǎng)基需由具備相應(yīng)檢驗(yàn)?zāi)芰ι唐坊从眯团囵B(yǎng)基

并取得通過國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可資質(zhì)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)出具的檢測(cè)報(bào)告。以即用形式或熔化后即用形式置于容器如平皿試管或其他容器或載體內(nèi)供應(yīng)的液體固體或半固體培養(yǎng)基:完全可即用的培養(yǎng)基如測(cè)試片等;需重新熔化的培養(yǎng)基如用于平板傾注技術(shù);使用前需重新熔化分裝如傾注到平皿的培養(yǎng)基如制劑培養(yǎng)基;使用前需重新熔化添加物質(zhì)并分裝的培養(yǎng)基如C培養(yǎng)基和r瓊脂。注測(cè)試片的測(cè)試方法及評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)參照附錄無法參照附錄F部分如菌落形態(tài)可參考生產(chǎn)企業(yè)提供的操作說明來執(zhí)行。商品化脫水合成培養(yǎng)基使用前需加水和進(jìn)行處理的干燥培養(yǎng)基如粉末小顆粒凍干等形式:完全培養(yǎng)基使用的時(shí)候無須加入其他成分;不完全培養(yǎng)基使用的時(shí)候需加入添加劑。自制培養(yǎng)基依據(jù)培養(yǎng)基完整配方的具體成分實(shí)驗(yàn)室自行制備的培養(yǎng)基。試劑用于食品微生物檢驗(yàn)的試劑和培養(yǎng)基配制的配套試劑。測(cè)試菌株通常用于培養(yǎng)基性能測(cè)試的微生物。注測(cè)試菌株根據(jù)其來源不同見可進(jìn)一步定義。標(biāo)準(zhǔn)菌株直接從專業(yè)菌種保藏機(jī)構(gòu)獲得并至少定義到屬或種水平的菌株。按菌株特性進(jìn)行分類和描述最好來源于食品水或其生產(chǎn)環(huán)境中的菌株。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株將標(biāo)準(zhǔn)菌株在實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)接一代后得到的一套完全相同的獨(dú)立菌株。儲(chǔ)備菌株從標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株轉(zhuǎn)接一代獲得的獨(dú)立菌株。工作菌株由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品或標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株儲(chǔ)備菌株轉(zhuǎn)接一代獲得的直接用于測(cè)試使用的菌株。注標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品是指含有一定數(shù)量活菌符合預(yù)期用途并足夠均勻和穩(wěn)定的材料。3B4培養(yǎng)基及試劑質(zhì)量保證證明文件生產(chǎn)企業(yè)提供的文件生產(chǎn)企業(yè)應(yīng)提供以下資料可提供電子文本:培養(yǎng)基或試劑的各種成分添加成分名稱及產(chǎn)品編號(hào);批號(hào);適用于培養(yǎng)基;貯存信息和有效期;標(biāo)準(zhǔn)要求及質(zhì)控報(bào)告;必要的安全和或危害數(shù)據(jù)。產(chǎn)品的交貨驗(yàn)收對(duì)每批產(chǎn)品應(yīng)記錄接收日期并檢查:產(chǎn)品合格證明材料;包裝的完整性;產(chǎn)品的有效期;其他必要的文件材料。貯存一般要求應(yīng)嚴(yán)格按照供應(yīng)商提供的貯存條件有效期和使用方法進(jìn)行培養(yǎng)基和試劑的保存和使用。商品化脫水合成培養(yǎng)基及其添加成分驗(yàn)收應(yīng)包括以下內(nèi)容:容器密閉性檢查;內(nèi)容物的感官檢查。開封后的脫水合成培養(yǎng)基其質(zhì)量取決于貯存條件。通過觀察粉末或顆粒的流動(dòng)性均勻性結(jié)塊情況和色澤變化等判斷脫水培養(yǎng)基的質(zhì)量變化。若發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基受潮或物理性狀發(fā)生明顯改變則不應(yīng)再使用。商品化即用型培養(yǎng)基和試劑應(yīng)嚴(yán)格按照供應(yīng)商提供的貯存條件有效期和使用方法進(jìn)行保存和使用。實(shí)驗(yàn)室自制培養(yǎng)基在保證其成分不會(huì)改變條件下保存即避光干燥保存必要時(shí)在2℃冰箱中保存通常建議平板保存期不超過4周瓶裝及試管裝培養(yǎng)基保存期不超過6個(gè)月。如需在培養(yǎng)基中添加不穩(wěn)定的添加劑應(yīng)即配即用含有活性化學(xué)物質(zhì)或不穩(wěn)定性成分的固體培養(yǎng)基也應(yīng)即配即用不可二次熔化。4B4培養(yǎng)基的貯存應(yīng)建立經(jīng)驗(yàn)證的有效期。觀察培養(yǎng)基是否有顏色變化蒸發(fā)脫水或微生物生長(zhǎng)的情況當(dāng)培養(yǎng)基發(fā)生這類變化時(shí)應(yīng)禁止使用。培養(yǎng)基使用或再次加熱前應(yīng)先取出平衡至室溫。培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)室制備一般要求正確制備培養(yǎng)基是微生物檢驗(yàn)的最基礎(chǔ)步驟之一使用脫水培養(yǎng)基和其他成分尤其是含有有毒有害物質(zhì)如膽鹽或其他選擇劑的成分時(shí)應(yīng)遵守良好實(shí)驗(yàn)室規(guī)范和生產(chǎn)廠商提供的使用說明。培養(yǎng)基的不正確制備會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基出現(xiàn)質(zhì)量問題見附錄。使用商品化脫水合成培養(yǎng)基制備培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按照廠商提供的使用說明配制如質(zhì)量體積、制備日期滅菌條件和操作步驟等。實(shí)驗(yàn)室使用各種基礎(chǔ)成分制備培養(yǎng)基時(shí)

應(yīng)按照配方準(zhǔn)確配

并記錄相關(guān)信息

如培養(yǎng)基名稱和類型及試劑級(jí)別每個(gè)成分物質(zhì)含量制造商批號(hào)培養(yǎng)基體積分裝體積無菌措施包括實(shí)施的方式溫度及時(shí)間配制日期人員等以便溯源。水試驗(yàn)用水的電導(dǎo)率在5℃時(shí)不應(yīng)超過5相當(dāng)于電阻率4除非另有規(guī)定要求。試驗(yàn)用水的微生物污染不應(yīng)超過/。應(yīng)按2定期檢驗(yàn)微生物污染水平。稱重和溶解準(zhǔn)確稱量所需量的脫水合成培養(yǎng)基必要時(shí)佩戴口罩或在通風(fēng)柜或抽氣罩下操作以防吸入培養(yǎng)基粉末等有害物質(zhì)先加入適量的水充分混合注意避免培養(yǎng)基結(jié)塊然后加水至所需的量后適當(dāng)加熱并重復(fù)或連續(xù)攪拌使其快速分散含瓊脂的培養(yǎng)基在加熱溶解前應(yīng)浸泡35。的測(cè)定和調(diào)節(jié)除特殊說明外滅菌后H應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)2范圍內(nèi)。一般使用濃度約為1L的氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的。分裝將配好的培養(yǎng)基分裝至適當(dāng)容器中培養(yǎng)基體積不應(yīng)超過容器容積的。除菌一般要求培養(yǎng)基應(yīng)采用濕熱滅菌法見或過濾除菌法見。某些培養(yǎng)基如不適用濕熱滅菌或過濾除菌的方式則可使用煮沸殺菌方式處理。濕熱滅菌具體培養(yǎng)基應(yīng)按食品微生物學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中的規(guī)定或者商品使用說明進(jìn)行滅菌。如培養(yǎng)基體積超過0應(yīng)使用生物指示劑或相應(yīng)設(shè)備進(jìn)行滅菌效果驗(yàn)證。所有的操作應(yīng)按照標(biāo)準(zhǔn)或使用說明的規(guī)定進(jìn)行。5B4加熱后采用適當(dāng)?shù)姆绞嚼鋮s以防加熱過度。這對(duì)于大容量和敏感培養(yǎng)基十分重要例如含有煌綠的培養(yǎng)基。過濾除菌過濾除菌可使用孔徑為m的無菌設(shè)備和濾膜過濾去除微生物。培養(yǎng)基的使用瓊脂培養(yǎng)基的熔化將培養(yǎng)基放入沸水浴中或采用有相同效果的方法如高壓鍋中的層流蒸汽使之熔化。經(jīng)過高壓的培養(yǎng)基應(yīng)盡量減少重新加熱時(shí)間。熔化后的培養(yǎng)基放入7℃0℃的恒溫裝置中冷卻保溫可根據(jù)實(shí)際培養(yǎng)基凝固溫度適當(dāng)提高恒溫裝置溫度直至使用培養(yǎng)基達(dá)到7℃0℃的時(shí)間與培養(yǎng)基的品種體積和數(shù)量有關(guān)。熔化后的培養(yǎng)基應(yīng)盡快使用放置時(shí)間不應(yīng)超過。未用完的培養(yǎng)基不能重新凝固留待下次使用。培養(yǎng)基的脫氧將培養(yǎng)基在使用前放到沸水浴或蒸汽浴中加熱5加熱時(shí)松開容器的蓋子加熱后蓋緊并迅速冷卻至使用溫度如液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基。添加成分的加入待培養(yǎng)基冷卻至7℃0℃時(shí)加入平衡至室溫的熱不穩(wěn)定添加成分避免造成瓊脂凝結(jié)或形成片狀物。將加入添加成分的培養(yǎng)基緩慢充分混勻盡快分裝至待用的容器中。平板的制備和貯存傾注熔化的培養(yǎng)基至平皿中直徑0m的平皿通常要加入5L0L瓊脂培養(yǎng)基使之在平皿中的厚度至少為3。將平皿蓋好皿蓋后放在水平平面使瓊脂冷卻凝固。如果平板需貯存,或者培養(yǎng)時(shí)間超過h或培養(yǎng)溫度高于0℃則需要傾注更多的培養(yǎng)基。凝固后的培養(yǎng)基應(yīng)立即使用或存放于暗處和或2℃8℃冰箱的密封袋中以防止培養(yǎng)基成分的改變。在平板底部或側(cè)邊做好標(biāo)記標(biāo)記的內(nèi)容包括名稱制備日期和或有效期。也可使用適宜的培養(yǎng)基編碼系統(tǒng)進(jìn)行標(biāo)記。對(duì)于采用表面接種形式培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基應(yīng)在生物安全柜或潔凈工作臺(tái)先對(duì)瓊脂表面進(jìn)行干燥。注意不要過度干燥。商品化的平板瓊脂培養(yǎng)基應(yīng)按照廠商提供的說明使用。培養(yǎng)基的棄置所有污染和未使用的培養(yǎng)基棄置應(yīng)采用安全的方式并且要符合相關(guān)法律法規(guī)的規(guī)定。測(cè)試菌株的保藏及使用一般要求為成功保藏及使用菌株不同菌株應(yīng)采用不同的保藏方法可選擇使用凍干保藏超低溫不高于0℃冷凍保藏液氮保藏或其他有效的保藏方法。商業(yè)來源的測(cè)試菌株對(duì)于從標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏中心或其他有效認(rèn)證的商業(yè)機(jī)構(gòu)獲得的原包裝測(cè)試菌株復(fù)蘇和使用應(yīng)按照6B4制造商提供的使用說明進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)室制備的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株用于性能測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株見附錄C中圖在保存和使用時(shí)應(yīng)注意避免交叉污染減少菌株突變或發(fā)生典型的特性變化標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株應(yīng)制備多份并采用超低溫不高于0℃或凍干的形式保存。在較高溫度下貯存時(shí)間應(yīng)縮短。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株用作培養(yǎng)基的測(cè)試菌株時(shí)應(yīng)在文件中充分描述其生長(zhǎng)特性。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株不能用于制備標(biāo)準(zhǔn)菌株。儲(chǔ)備菌株儲(chǔ)備菌株通常用凍干或超低溫保存的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株進(jìn)行制備見圖。制備儲(chǔ)備菌株應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株的交叉污染和或退化。制備儲(chǔ)備菌株時(shí)應(yīng)將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株制成菌懸液轉(zhuǎn)接至非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)以獲得特性穩(wěn)定的菌株。對(duì)于商業(yè)來源的菌株應(yīng)嚴(yán)格按照制造商的說明執(zhí)行。儲(chǔ)備菌株不能用于制備標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株或標(biāo)準(zhǔn)菌株。工作菌株工作菌株由標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株或儲(chǔ)備菌株制備。工作菌株不能用于制作標(biāo)準(zhǔn)菌株標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株或儲(chǔ)備菌株。培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求基本要求培養(yǎng)基和試劑培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量由基礎(chǔ)成分的質(zhì)量制備過程的控制微生物污染的消除及包裝和貯存條件等因素所決定。供應(yīng)商或制備者應(yīng)對(duì)基礎(chǔ)成分的質(zhì)量制備過程微生物污染的消除及包裝和貯存條件進(jìn)行控制,確保培養(yǎng)基和試劑的理化特性滿足相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的要求。培養(yǎng)基和試劑的各種成分添加劑或選擇劑應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量評(píng)價(jià)。附錄F中未描述的培養(yǎng)基和試劑應(yīng)根據(jù)以下規(guī)定進(jìn)行質(zhì)量控制:不含指示劑或選擇劑的培養(yǎng)基可根據(jù)培養(yǎng)基的使用范圍選擇菌株進(jìn)行測(cè)試;含有指示劑和選擇劑的培養(yǎng)基應(yīng)使用能證明指示劑和選擇性功能的菌株進(jìn)行測(cè)試;使用前需添加添加劑的培養(yǎng)基和鑒定試劑應(yīng)使用特征性的菌株進(jìn)行測(cè)試。基礎(chǔ)成分國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中列出的培養(yǎng)基成分通?？梢灾苯邮褂谩Ｒ蛴糜谥苽渑囵B(yǎng)基的部分成分見附錄質(zhì)量差異可允許對(duì)其用量進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整如:根據(jù)營(yíng)養(yǎng)需要改變胨類浸粉類的用量;根據(jù)所需凝膠作用的效果改變瓊脂的用量;根據(jù)緩沖要求決定緩沖物質(zhì)用量;根據(jù)選擇性要求決定膽鹽膽汁抽提物和脫氧膽酸鹽抗菌染料的用量;根據(jù)抗生素的效價(jià)決定其用量。7B4微生物學(xué)要求概論培養(yǎng)基和試劑應(yīng)達(dá)到附錄F質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的要求其性能測(cè)試方法按第6章執(zhí)行。實(shí)驗(yàn)室使用商品化培養(yǎng)基和試劑時(shí)應(yīng)保留生產(chǎn)商按1提供的資料并制定驗(yàn)收程序。如果生產(chǎn)商能提供具備相應(yīng)檢驗(yàn)?zāi)芰Σ⑷〉脟?guó)家相關(guān)認(rèn)證認(rèn)可資質(zhì)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)出具的同批次產(chǎn)品檢驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)室可保留相關(guān)證明文件根據(jù)實(shí)際需求對(duì)該批次培養(yǎng)基的性能進(jìn)行重復(fù)測(cè)試附錄F中未包含的培養(yǎng)基和試劑可根據(jù)培養(yǎng)基和試劑的性能參考附錄F建立方法進(jìn)行檢驗(yàn)。生長(zhǎng)特性一般要求選擇下列方法對(duì)每批成品培養(yǎng)基或試劑進(jìn)行評(píng)價(jià):定量方法;半定量方法;定性方法。采用定量方法時(shí)應(yīng)使用參比培養(yǎng)基見附錄作為對(duì)照采用半定量和定性方法時(shí)使用能得到陽性結(jié)果的培養(yǎng)基作為對(duì)照有助于結(jié)果的解釋。生長(zhǎng)率按規(guī)定用適當(dāng)方法將適量測(cè)試菌株的工作菌懸液接種至固體半固體和液體培養(yǎng)基中。每種培養(yǎng)基上菌株的生長(zhǎng)率應(yīng)達(dá)到所規(guī)定的最低限值見附錄。選擇性為定量評(píng)估培養(yǎng)基的選擇性應(yīng)按照規(guī)定以適當(dāng)方法將適量測(cè)試菌株的工作培養(yǎng)物接種至選擇性培養(yǎng)基和參比培養(yǎng)基中培養(yǎng)基的選擇性應(yīng)達(dá)到規(guī)定值見附錄。生理生化特性特異性)確定培養(yǎng)基的菌落形態(tài)特征鑒別特性或試劑的鑒別特性以獲得培養(yǎng)基或試劑的基本特性見附錄。性能評(píng)價(jià)和結(jié)果解釋若使用規(guī)定的所有測(cè)試菌株培養(yǎng)基或試劑的性能測(cè)試達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)要求則該批培養(yǎng)基或試劑的性能測(cè)試結(jié)果符合規(guī)定。若基本要求和微生物學(xué)要求均符合規(guī)定則該批培養(yǎng)基或試劑可被接受。培養(yǎng)基和試劑性能測(cè)試方法非選擇性分離和計(jì)數(shù)固體培養(yǎng)基目標(biāo)菌生長(zhǎng)率定量測(cè)試方法工作菌懸液的制備將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株儲(chǔ)備菌株或工作菌株接種到非選擇性肉湯培養(yǎng)過夜或采用其他方法制備0倍系列稀釋的菌懸液。進(jìn)行生長(zhǎng)率測(cè)試時(shí)細(xì)菌和酵母菌每平板的接種水平為00霉菌每平板的接種水平為00。8B4接種選擇適宜稀釋度的工作菌懸液1均勻涂布接種于待測(cè)平板和參比平板。每一稀釋度接種兩個(gè)平板。也可使用螺旋涂布法或傾注法進(jìn)行接種并按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的條件培養(yǎng)。計(jì)算參考2的要求選擇菌落數(shù)適中的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)生長(zhǎng)率按式計(jì)算。式中:NOPR生長(zhǎng)率NO

PR=NS

…………1)NS待測(cè)培養(yǎng)基平板上的菌落總數(shù)平均值;NO參比培養(yǎng)基平板上的菌落總數(shù)平均值。結(jié)果解釋非選擇性分離和計(jì)數(shù)固體培養(yǎng)基上目標(biāo)菌的生長(zhǎng)率應(yīng)不小于。選擇性分離和計(jì)數(shù)固體培養(yǎng)基測(cè)試方法目標(biāo)菌生長(zhǎng)率定量測(cè)試方法工作菌懸液的制備按照1中要求進(jìn)行。接種按照2中要求進(jìn)行。計(jì)算按照3中要求進(jìn)行。結(jié)果解釋目標(biāo)菌在培養(yǎng)基上應(yīng)呈現(xiàn)典型的生長(zhǎng)。選擇性分離固體培養(yǎng)基上目標(biāo)菌的生長(zhǎng)率一般應(yīng)不小于最低應(yīng)為選擇性計(jì)數(shù)固體培養(yǎng)基上目標(biāo)菌的生長(zhǎng)率一般應(yīng)不小于。具體要求參照附錄F培養(yǎng)基質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。非目標(biāo)菌選擇性半定量測(cè)試方法工作菌懸液的制備將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株儲(chǔ)備菌株或工作菌株接種到非選擇性肉湯培養(yǎng)過夜作為工作菌懸液。接種用L接種環(huán)取選擇性測(cè)試工作菌懸液1環(huán)在待測(cè)培養(yǎng)基表面劃六條平行直線見圖同時(shí)接種兩個(gè)平板劃線時(shí)可在培養(yǎng)基下面放一個(gè)模板圖按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的條件培養(yǎng)。取一滿環(huán)接種物將接種環(huán)接觸容器邊緣3次可去除多余的液體。劃線時(shí)接種環(huán)與瓊脂平面的角9B4度應(yīng)為。接種環(huán)壓在瓊脂表面的壓力和劃線速度前后一致整個(gè)劃線應(yīng)快速連續(xù)移取液體培養(yǎng)物時(shí)應(yīng)將接種環(huán)伸入培養(yǎng)液下部分以防止環(huán)上產(chǎn)生氣泡或泡沫。計(jì)算

圖1非目標(biāo)菌半定量劃線法接種模式圖培養(yǎng)后按以下方法對(duì)培養(yǎng)基計(jì)算生長(zhǎng)指數(shù)。每條有比較稠密菌落連續(xù)生長(zhǎng)的劃線計(jì)為1分每個(gè)培養(yǎng)皿上最多為6分。如果僅一半的線有稠密菌落生長(zhǎng)則計(jì)為5分。如果劃線上沒有菌落生長(zhǎng)、生長(zhǎng)量少于劃線的一半或菌落生長(zhǎng)微弱則計(jì)為0分。記錄每個(gè)平板的得分總和便得到。結(jié)果解釋非目標(biāo)菌的生長(zhǎng)指數(shù)G一般小于或等于至少應(yīng)小于。非目標(biāo)菌特異性定性測(cè)試方法工作菌懸液的制備按照1中要求進(jìn)行。接種用接種環(huán)取測(cè)試菌培養(yǎng)物在測(cè)試培養(yǎng)基表面進(jìn)行分區(qū)劃線。并按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的培養(yǎng)條件培養(yǎng)平板。結(jié)果解釋非目標(biāo)菌不生長(zhǎng)或微弱生長(zhǎng)。非選擇性增菌培養(yǎng)基半定量測(cè)試方法培養(yǎng)基的制備將培養(yǎng)基分裝試管每管0。工作菌懸液的制備將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株儲(chǔ)備菌株或工作菌株接種到非選擇性肉湯培養(yǎng)過夜或采用其他制備方法制備0倍系列稀釋的菌懸液。0B4接種在裝有待測(cè)培養(yǎng)基的試管中接種00U的目標(biāo)菌接種體積不超過1接種兩個(gè)平行管。同時(shí)將1L菌懸液與試管接種同一稀釋度傾注平板或適宜稀釋度1L涂布平板接種兩個(gè)平板作接種量計(jì)數(shù)用。按標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的培養(yǎng)時(shí)間和溫度進(jìn)行培養(yǎng)如增菌時(shí)間為8h以下需取L培養(yǎng)后的增菌液傾注適合的培養(yǎng)基中再按適合的培養(yǎng)時(shí)間和溫度進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果解釋用目測(cè)的濁度值如評(píng)估培養(yǎng)基:0表示無渾濁;1表示輕微的渾濁;2表示明顯的渾濁。目標(biāo)菌的濁度值應(yīng)為。有時(shí)可以觀察到微生物生長(zhǎng)后聚集成細(xì)胞團(tuán)試管后再進(jìn)行觀察。

沉積在試管或瓶子底

發(fā)生這種情況時(shí)

小心振蕩如增菌h以下L增菌液培養(yǎng)計(jì)數(shù)結(jié)果參照附錄F培養(yǎng)基質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。選擇性增菌培養(yǎng)基半定量測(cè)試方法培養(yǎng)基的制備將培養(yǎng)基分裝試管每管0。工作菌懸液的制備按照1中要求進(jìn)行。接種目標(biāo)菌的接種在裝有待測(cè)培養(yǎng)基的試管中接種00U的目標(biāo)菌特殊接菌量參照附錄F培養(yǎng)基質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)接種體積不超過1同時(shí)接種兩個(gè)平行管混勻。將相同體積的目標(biāo)菌菌懸液與試管接種同一稀釋度傾注平板或適宜稀釋度1L涂布平板接種兩個(gè)平板作接種量計(jì)數(shù)用。按標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的培養(yǎng)時(shí)間和溫度進(jìn)行培養(yǎng)。非目標(biāo)菌的接種在裝有待測(cè)培養(yǎng)基的試管中接種00U的非目標(biāo)菌接種體積不超過1同時(shí)接種兩個(gè)平行管混勻。同時(shí)將1L菌懸液比待測(cè)培養(yǎng)基試管接種小0倍0倍稀釋度傾注平板或適宜稀釋度1L涂布平板接種兩個(gè)平板作接種量計(jì)數(shù)用。按標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的培養(yǎng)時(shí)間和溫度進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)液的接種目標(biāo)菌培養(yǎng)液的接種吸取L經(jīng)培養(yǎng)后的目標(biāo)菌培養(yǎng)液均勻涂布或螺旋涂布接種到特定的選擇性平板上見。按標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的培養(yǎng)時(shí)間和溫度進(jìn)行培養(yǎng)。1B4非目標(biāo)菌培養(yǎng)液的接種吸取L經(jīng)培養(yǎng)后的非目標(biāo)菌培養(yǎng)液均勻涂布或螺旋涂布接種到非選擇性平板如上。并按標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的培養(yǎng)條件培養(yǎng)平板。計(jì)算和結(jié)果解釋目標(biāo)菌在選擇性平板上的菌落應(yīng)0則表示待測(cè)液體培養(yǎng)基的生長(zhǎng)率良好非目標(biāo)菌在非選擇性平板上的菌落數(shù)應(yīng)0則表示待測(cè)液體培養(yǎng)基的選擇性為良好。選擇性液體計(jì)數(shù)培養(yǎng)基半定量測(cè)試方法培養(yǎng)基的制備將培養(yǎng)基分裝試管每管0。工作菌懸液的制備按照2中要求進(jìn)行。接種目標(biāo)菌的接種在裝有待測(cè)培養(yǎng)基的試管中接種00U的目標(biāo)菌接種體積不超過1同時(shí)接種兩個(gè)平行管混勻。將相同體積的目標(biāo)菌菌懸液與試管接種同一稀釋度傾注平板或適宜稀釋度1L涂布平板接種兩個(gè)平板作接種量計(jì)數(shù)用。按標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的培養(yǎng)時(shí)間和溫度進(jìn)行培養(yǎng)。非目標(biāo)菌的接種在裝有待測(cè)培養(yǎng)基的試管中接種00U的非目標(biāo)菌接種體積不超過1同時(shí)接種兩個(gè)平行管混勻。同時(shí)將1L菌懸液比試管接種小0倍0倍稀釋度傾注平板或適宜稀釋度1L涂布平板接種兩個(gè)平板作接種量計(jì)數(shù)用。按標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的培養(yǎng)時(shí)間和溫度進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果解釋用目測(cè)的濁度值如評(píng)估培養(yǎng)基:0表示無渾濁;1表示輕微的渾濁;2表示明顯的渾濁。并記錄小導(dǎo)管收集氣體的體積比。注有時(shí)可以觀察到微生物生長(zhǎng)后聚集成細(xì)胞團(tuán)沉積在試管或瓶子底部發(fā)生這種情況時(shí)小心振蕩試管混勻后再進(jìn)行觀察。懸浮培養(yǎng)基和運(yùn)輸培養(yǎng)基定量測(cè)試方法培養(yǎng)基的制備將培養(yǎng)基分裝試管每管0有特殊要求的可選用5。2B4目標(biāo)菌工作菌懸液的制備按照2中要求進(jìn)行。接種在裝有待測(cè)培養(yǎng)基的試管中接種00U的目標(biāo)菌同時(shí)接種兩個(gè)平行管混勻后,立即吸取1待測(cè)培養(yǎng)基混合液參照附錄F培養(yǎng)基質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)選用相應(yīng)的培養(yǎng)基傾注平板每管待測(cè)培養(yǎng)基接種一個(gè)平板。按標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的培養(yǎng)時(shí)間和溫度培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。剩余已接種菌液的待測(cè)培養(yǎng)基0℃5℃下放置5n后再吸取1L傾注平板每管培養(yǎng)基接種一個(gè)平板按標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的培養(yǎng)時(shí)間和溫度培養(yǎng)后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。如保存條件有特殊要求的待測(cè)培養(yǎng)基參照附錄F培養(yǎng)基質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)要求放置或培養(yǎng)后再進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。結(jié)果觀察與解釋待測(cè)培養(yǎng)基中的菌落數(shù)變化應(yīng)在0內(nèi)。鑒定培養(yǎng)基測(cè)試方法液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基的制備將培養(yǎng)基分裝試管再進(jìn)行滅菌和添加試劑。工作菌懸液的制備將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株儲(chǔ)備菌株或工作菌株接種到非選擇性平板上或采用其他制備方法制備成約9L的菌懸液。接種吸取5L至待測(cè)培養(yǎng)基內(nèi)按標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的培養(yǎng)時(shí)間和溫度進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果觀察與解釋需加指示劑的試驗(yàn)在微生物生長(zhǎng)良好的情況下按順序加入指示劑再觀察結(jié)果。結(jié)果解釋參照表。半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)基的制備將培養(yǎng)基分裝試管。滅菌后豎立放置冷卻后備用。接種取新鮮測(cè)試菌株用接種針挑取菌苔穿刺接種至待測(cè)培養(yǎng)基內(nèi)。按標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的培養(yǎng)時(shí)間和溫度進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果觀察與解釋需加指示劑的試驗(yàn)在微生物生長(zhǎng)良好的情況下按順序加入指示劑再觀察結(jié)果。結(jié)果解釋參照3B4表。高層斜面培養(yǎng)基和斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)基的制備將培養(yǎng)基分裝試管。滅菌后擺放成高層斜面斜面與底層高度之比約為和普通斜面斜面與底層高度之比約為冷卻后備用。接種高層斜面培養(yǎng)基取新鮮測(cè)試菌株斜面用接種針挑取菌苔根據(jù)培養(yǎng)基接種要求可選擇先穿刺接種至瓊脂高層穿刺接種完畢后再在斜面上劃之字形劃線接種或先在斜面上劃之字形劃線接種再穿刺接種斜面培養(yǎng)基取新鮮測(cè)試菌株斜面用接種環(huán)挑取菌苔在斜面上劃之字形劃線接種。按標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的培養(yǎng)時(shí)間和溫度進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果觀察與解釋需加指示劑的試驗(yàn)在微生物生長(zhǎng)良好的情況下按順序加入指示劑再觀察結(jié)果。結(jié)果解釋參照表。平板培養(yǎng)基培養(yǎng)基的制備傾注滅菌熔化的培養(yǎng)基至平皿中使之在平皿中形成至少3m厚的瓊脂層直徑0m的平皿通常要加入8L0L瓊脂培養(yǎng)基。接種取新鮮測(cè)試菌株用接種環(huán)挑取菌苔在平板上劃之字形接種或用接種針挑取菌苔在平板上點(diǎn)種接種。按標(biāo)準(zhǔn)方法中規(guī)定的培養(yǎng)時(shí)間和溫度進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果觀察與解釋參照表。實(shí)驗(yàn)試劑測(cè)試方法試驗(yàn)方法按試劑說明書進(jìn)行。結(jié)果觀察與解釋參照表。4B4附 錄A培養(yǎng)基性能測(cè)試方法流程圖固體培養(yǎng)基目標(biāo)菌生長(zhǎng)率定量測(cè)試方法見圖。圖1固體培養(yǎng)基目標(biāo)菌生長(zhǎng)率定量測(cè)試方法流程圖固體培養(yǎng)基非目標(biāo)菌選擇性半定量測(cè)試方法見圖。圖2固體培養(yǎng)基非目標(biāo)菌選擇性半定量測(cè)試方法流程圖5B4固體培養(yǎng)基非目標(biāo)菌特異性定性測(cè)試方法見圖。圖3固體培養(yǎng)基非目標(biāo)菌特異性定性測(cè)試方法流程圖非選擇性增菌培養(yǎng)基半定量測(cè)試方法見圖。圖4非選擇性增菌培養(yǎng)基半定量測(cè)試方法流程圖6B4選擇性增菌培養(yǎng)基半定量測(cè)試方法見圖。圖5選擇性增菌培養(yǎng)基半定量測(cè)試方法流程圖選擇性液體計(jì)數(shù)培養(yǎng)基半定量測(cè)試方法見圖。圖6選擇性液體計(jì)數(shù)培養(yǎng)基半定量測(cè)試方法流程圖7B4懸浮培養(yǎng)基和運(yùn)輸培養(yǎng)基定量測(cè)試方法見圖。圖7懸浮培養(yǎng)基和運(yùn)輸培養(yǎng)基定量測(cè)試方法流程圖8B4附 錄B培養(yǎng)基不正確配制出現(xiàn)的質(zhì)量問題及原因分析培養(yǎng)基不正確配制出現(xiàn)的質(zhì)量問題及原因分析見表。表1常見質(zhì)量問題與解答異?，F(xiàn)象可能原因培養(yǎng)基不能凝固制備過程中過度加熱低pH造成培養(yǎng)基酸解稱量不正確瓊脂未完全溶解培養(yǎng)基成分未充分混勻pH不正確制備過程中過度加熱水質(zhì)不佳外部化學(xué)物質(zhì)污染測(cè)定pH時(shí)溫度不正確pH計(jì)未正確校準(zhǔn)脫水培養(yǎng)基質(zhì)量差顏色異常制備過程中過度加熱水質(zhì)不佳不正確外來污染脫水培養(yǎng)基質(zhì)量差產(chǎn)生沉淀制備過程中過度加熱水質(zhì)不佳脫水培養(yǎng)基質(zhì)量差pH未正確控制原料中的雜質(zhì)培養(yǎng)基出現(xiàn)抑制/低生長(zhǎng)率制備過程中過度加熱脫水培養(yǎng)基質(zhì)量差水質(zhì)不佳使用成分不正確如成分稱量不準(zhǔn)添加劑濃度不正確制備容器或水中有毒殘留物選擇性差制備過程中過度加熱脫水培養(yǎng)基質(zhì)量差配方使用不對(duì)添加成分加入不正確例如加入添加成分時(shí)培養(yǎng)基過熱或添加濃度錯(cuò)誤添加劑污染污染不適當(dāng)滅菌無菌操作技術(shù)存在問題添加劑污染9B4附 錄C標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株和工作菌株制備 kkkkkkkk標(biāo)準(zhǔn)菌株制備標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株流程見圖 kkkkkkkka通常懸浮于營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)適宜時(shí)間進(jìn)行復(fù)蘇。b驗(yàn)證菌落形態(tài)和革蘭氏染色或用生化試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。c例如添加00甘油作為冷凍保護(hù)培養(yǎng)基。d凍存管可含有多孔小珠子。e在不高于0℃低溫下冷凍保存可延長(zhǎng)保存的時(shí)間在較高溫度下保存時(shí)間將縮短。圖1制作標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株的流程圖0kkkkkkkkkkkB4kkkkkkkkkkk標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株制備工作菌株的流程見圖。a如果標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株來源于別處應(yīng)加以驗(yàn)證及歸檔包括核查能否溯源至標(biāo)準(zhǔn)菌株及相關(guān)特性。b此流程適用于一般試驗(yàn)。c此流程對(duì)某些菌株是必需的如定量試驗(yàn)。應(yīng)對(duì)所有階段資料進(jìn)行歸檔。d例如可接種到A斜面A血瓊脂斜面或其他合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)然后在適宜的溫度依據(jù)不同微生物在8℃5℃或2℃8℃可存放4周。e例如添加00甘油作為冷凍保護(hù)培養(yǎng)基。在不高于0℃低溫冷凍保存可延長(zhǎng)保存的時(shí)間在較高溫度下保存時(shí)間將縮短。圖2制作工作菌株的流程圖1B4附 錄D食品安全微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中指定的培養(yǎng)基成分胨類蛋白胨胃蛋白酶或胰酶消化動(dòng)物組織水解物胰蛋白胨或胰酪胨、胰酶消化酪蛋白胨酪蛋白胰酶水解物蛋白胨胰酶低程度消化酪蛋白水解物多價(jià)蛋白胨酪蛋白胨和蛋白胨等的混合物明膠蛋白胨胰酶消化明膠水解物大豆蛋白胨木瓜蛋白酶消化大豆蛋白的水解物酸水解酪蛋白鹽酸消化酪蛋白的水解物浸粉類大部分浸粉是將植物或動(dòng)物組織切開研碎去除雜質(zhì)洗干凈后加適量純化水后放置2℃0℃浸泡然后加熱或煮沸適當(dāng)時(shí)間調(diào)節(jié)過濾噴霧干燥而成。浸粉中富含生長(zhǎng)促進(jìn)因子維生素或高碳水化合物能促進(jìn)微生物快速生長(zhǎng)發(fā)育。而酵母浸粉是以高蛋白面包酵母或啤酒酵母為原料經(jīng)自溶酶解濃縮干燥等工藝制成的一種富含蛋白質(zhì)氨基酸肽多肽核酸維生素及微量元素等的營(yíng)養(yǎng)成分。主要浸粉:牛肉浸粉牛心浸粉牛腦浸粉腦心浸粉牛肝浸粉酵母浸粉馬鈴薯浸粉麥芽浸粉豌豆浸粉、玉米浸粉。膽鹽及膽汁類牛膽鹽豬膽鹽3號(hào)膽鹽去氧膽酸鈉牛膽汁粉豬膽汁粉。凝固劑類瓊脂明膠。其他亞碲酸鹽卵黃乳液卵黃乳液脫脂奶粉兔血漿兔血球脫纖維羊血。2B4附 錄E食品安全微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中參比培養(yǎng)基的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)食品安全微生物檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中參比培養(yǎng)基的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)如下參比培養(yǎng)基具體檢驗(yàn)方法可參考1或。沙氏葡萄糖瓊脂dr參比培養(yǎng)基質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)成分蛋白胨 g酪蛋白胨 g葡萄糖 g瓊脂 g原理葡萄糖提供碳源蛋白胨和胰蛋白胨提供氮源瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。制法將上述成分加熱溶解于0L蒸餾水中1℃高壓滅菌5n備用。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)見表。表1A參比培養(yǎng)基質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目質(zhì)控指標(biāo)質(zhì)控條件質(zhì)控評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)理化外觀—淡黃色粉末滅菌后為淡黃色透明膠體pH1℃高壓滅菌5n后傾倒平板待室溫凝固后測(cè)定2促生長(zhǎng)能力測(cè)試菌株培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)時(shí)間菌落形態(tài)黑曲霉38℃1℃h生長(zhǎng)良好白色菌絲黑色孢子白色念珠菌18℃1℃h生長(zhǎng)良好白色圓形菌落釀酒酵母88℃1℃h生長(zhǎng)良好奶油色圓形菌落桔青霉88℃1℃h生長(zhǎng)良好白色菌絲綠色孢子產(chǎn)黃青霉18℃1℃h生長(zhǎng)良好白色菌絲綠色孢子3B4S瓊脂參比培養(yǎng)基質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)成分蛋白胨 g牛肉浸粉 g酵母浸粉 g葡萄糖 g吐溫0

( · )

0L七水合磷酸氫二鉀

4O

g三水合醋酸鈉) g檸檬酸三銨743] g七水合硫酸鎂4) g四水合硫酸錳4) g瓊脂 g原理蛋白胨牛肉浸粉酵母浸粉提供氮源維生素生長(zhǎng)因子葡萄糖為可發(fā)酵糖類七水合磷酸氫二鉀為酸堿緩沖劑檸檬酸三銨七水合硫酸鎂四水合硫酸錳吐溫0和三水合醋酸鈉為培養(yǎng)各種乳酸菌提供生長(zhǎng)因子其成分還能抑制某些雜菌瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。制法加熱溶解于0L蒸餾水中1℃高壓滅菌5n備用。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)見表。表2S瓊脂參比培養(yǎng)基質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目質(zhì)控指標(biāo)質(zhì)控條件質(zhì)控評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)理化外觀—為淡黃色均勻粉末。加入水中混懸均勻滅菌后為琥珀色透明膠體pH1℃高壓滅菌5n后傾倒平板待室溫凝固后測(cè)定2微生物測(cè)試菌株培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)時(shí)間菌落形態(tài)德氏乳桿菌保加利亞亞種16℃1℃h生長(zhǎng)良好淺灰色邊緣不規(guī)則嗜熱鏈球菌36℃1℃h生長(zhǎng)良好白色圓形長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種CMCC56℃1℃厭氧生長(zhǎng)良好白色圓形瑞士乳桿菌26℃1℃h生長(zhǎng)良好白色圓形4B4表2S瓊脂參比培養(yǎng)基質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)續(xù))項(xiàng)目質(zhì)控指標(biāo)質(zhì)控條件質(zhì)控評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)微生物戊糖乳桿菌76℃1℃h生長(zhǎng)良好白色圓形植物乳桿菌46℃1℃h生長(zhǎng)良好白色圓形干酪乳酪桿菌56℃1℃h生長(zhǎng)良好白色圓形胰蛋白胨大豆瓊脂參比培養(yǎng)基質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)成分胰蛋白胨 g大豆蛋白胨 g氯化鈉 g瓊脂 g原理胰蛋白胨大豆蛋白胨提供氮源維生素和生長(zhǎng)因子氯化鈉維持均衡的滲透壓瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。制法取上述成分加熱溶解于0L蒸餾水中1℃高壓滅菌5n備用5裂解羊血為在A基礎(chǔ)上添加5裂解羊血3氯化鈉A為在A基礎(chǔ)上添加5氯化鈉。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)見表。表3A參比培養(yǎng)基質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目質(zhì)控指標(biāo)質(zhì)控條件質(zhì)控評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)理化外觀—為淡黃色粉末滅菌后為淡黃色透明膠體pH1℃高壓滅菌5n后傾倒平板待室溫凝固后測(cè)定2微生物測(cè)試菌株a培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)時(shí)間菌落形態(tài)莫氏克羅諾桿菌75℃1℃h生長(zhǎng)良好菌落黃色圓形表面光滑濕潤(rùn)大腸埃希氏菌26℃1℃h生長(zhǎng)良好菌落灰白色圓形表面光滑濕潤(rùn)金黃色葡萄球菌36℃1℃h生長(zhǎng)良好菌落淡黃色圓形5B4表3A參比培養(yǎng)基質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)續(xù))項(xiàng)目質(zhì)控指標(biāo)質(zhì)控條件質(zhì)控評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)微生物枯草芽孢桿菌16℃1℃h生長(zhǎng)良好,干燥, , ,白色念珠菌18℃1℃h生長(zhǎng)良好菌落白色圓形表面光滑濕潤(rùn)黑曲霉38℃1℃h生長(zhǎng)良好產(chǎn)黑色孢子糞腸球菌06℃1℃h生長(zhǎng)良好菌落白色圓形人參土芽孢桿菌26℃1℃h生長(zhǎng)良好菌落灰白色圓形藤黃微球菌16℃1℃h生長(zhǎng)良好菌落淺黃色圓形嗜熱嗜脂肪地芽孢桿菌96℃1℃h灰白色圓形表面光滑濕潤(rùn)a參比培養(yǎng)基測(cè)試菌株一覽表見表4表4參比培養(yǎng)基測(cè)試菌株一覽表序號(hào)a中文名拉丁名CMCC編號(hào)bC編號(hào)c編號(hào)d1白色念珠菌白假絲酵母)s1582莫氏克羅諾桿菌ri7663產(chǎn)黃青霉m1004大腸埃希氏菌i2635德氏乳桿菌保加利亞亞種sis1136糞腸球菌s0727干酪乳酪桿菌i5558黑曲霉r3769金黃色葡萄球菌s3410桔青霉m8931枯草芽孢桿菌s1522釀酒酵母e8233人參土芽孢桿菌i2894瑞士乳桿菌s—2—5嗜根考克氏菌藤黃微球菌)aa-)1566嗜熱鏈球菌ss3207嗜熱脂肪地芽孢桿菌ss9916B4表4參比培養(yǎng)基測(cè)試菌株一覽表續(xù))序號(hào)a中文名拉丁名CMCC編號(hào)bC編號(hào)c編號(hào)d8戊糖乳植物桿菌ss3719長(zhǎng)雙歧桿菌嬰兒亞種mms5370植物乳桿菌植物乳植物桿菌)msm)448a為方便檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室菌種獲取同一序號(hào)菌種如出現(xiàn)不同菌種編號(hào)全部為同一株菌在三家菌種保藏管理中心注冊(cè)獲得。b代表中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心。cC代表中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。d代表廣東省微生物菌種保藏管理中心。7! fi1#?%?"?)?$-$/??5! fi1#?%?"?)?$-$/??5?7?‰?#flfl&'$$+§-a/ 2345?‰?$~$!"?=>y??ABC$-$/?5?7?‰L??tP——?§ofi4¤fit v?wa$zz%??tfl?§}fi4¤??fivflz???tfl?wofi4¤??fivflz????§}fi4¤???$vfiv?z??w24???‰’’’’fiI?3?3?3?3Ffl+§-T*ATR*TR*?flflT*A?/?fl*}$????1e2f$g?2e2j?‰g?8gT~fl?2j?‰g?8fi??fl?@"a?fi?+§)??%fl?3e24fifl?4e2+§Afl4C1C14C114C1C14C1124?flfi`flfi`flfi`flfi`fl=y?[???y$[???hi[???hi[???y$:;YflYflYflYfl+§-Q$$T}VWX+§-*+§-?flflQ$$T}VWX)$$1"?$%y??)*+$-$/"?$%y??)*+$-$/?1?3?‰!)<??t@———$U}~tfl??$U}~??$U?€?U\?$~$’?*$??2?fl?3??fl3??fi§??2??%+,???‰’’’’’fi8?^?^?^?^?^5fl"§$T*AT*AT*ATR**DA?2?fl*}$????1R2?TUVfiX??R8Y$z\fl?2R3ijklmfln?<??2R?}$????1R2?TUVfiX??R8Y$z\fl?2R3fi?ufl?@"a?9??`’???9"§/fl4C1C14C1C14C114C1C,fi?

C1C1+,?flfiLflfiLflfiLflfiLflfiLfl(y*F???y$F???y$F???rsF???rsF???rs%&DflDflDflDflDfl"§$A§BC`sefg}hBC)pqrsBC)?ufl?BC"§$??Vfi?BC$$1?#$y??()*$,$.?0?2?‰?#$y??()*$,$.?0?2?‰;??t?ab?c$?ffi8abYfijb?c$?ffi8—kb?c$alkb?c—ab?cfib?cfial—??????????????????—*+???‰?*“1?—*“1?*“1?——*“1fi7?_`?_?_??`?_?_`?_?_??`?_4fl!§#T*A—T*A—T*A—T*A—?1?fl*$OP??$a?fiT%VW1$OP??$a??fiT%VW4Y8}$????1Y2]$^?2Y2$OP??$a??fiT%VW4Y8m?o??2]$^?2Y2$OP??$a??fiT%VW4Y8m?o??2?xbyfi^??Y8$OP??$a??fiT%VW4Y8}$????1Y2~aq€??]$^?2Y2!§.fl4C1C14C1C14C1C14C1C1*+?flfiM???flfiM???flfiM???flfiM;a????fl'y)???y$???y$???y$???y$$%FflFflFflFfl!§#aABCDE)DE$q?@B??v?DE)OP??|b!§#$$2?#$y??()*$,$.?0?2?‰?#$y??()*$,$.?0?2?‰!)<??t@fi\]?^?`6fic]?t$c]—rs?]S??]a$wxyzfi]Y}??]gz?]S\]?^—???????????????—?]$?%?^—+,???‰?*“1?*“1?——*“1?*“1fi8?Zg?Z?Zg?Z?Z??g?Z?Zg?Z5fl"§$T*A—T*A—T*A—T*A—?2?fl*KLMNOflP?<??2S?}$????1S2X$Y?2S2}$????1S2k?m??2?o]pfiY??S8??t?fl??S4‰?q??’}$????1S2X$Y?2S2fi$?$??‰÷??4}$????1S2?o]pfiY??S8"§/fl4C1C14C1C14C1C14C11+,?flfiJ???flfiJ???flfiJ<a????flfiJ???fl(y*???y$???y$???y$???y$%&CflCflCflCfl"§$AB@fiAB)??$fl??]"§$1"§$$$2?#$y??()*$,$.?0?2?‰?#$y??()*$,$.?0?2?‰!)<??t@fiVzXfl¤??\??V?\—nV?\o?pfi8?\ofiVhzX—fiV?\??o??fi?V??V?\?t$????—??X?????X???—+,???‰?—*“1?—*<??—*“1?—*“1fi8?T??h?T?T??h?T?T??h?T?T??h?T5fl"§$T*A—T*A——T*A—T*A——?2?fl*fi$N$OP‰÷??4}$????1`2?dVefig??`8}$????1`2$st??$a??fiy%{|4`8?dVefig??`8}$????:’9}$????1`2?dVefig??`8}$????’9}$????1`2?$g?2`2?aq???"§/fl4C114C1C14C1C14C1C1+,?flfiJ<a????flfiJ<a????flfiJ<a????flfiJ<a????fl(y*???y$???y$???y$???y$%&CflCflCflCfl"§$A$*"§$?$klm)A$?€@lm)}$????’?V"§$$$2?#$y??()*$,$.?0?2?‰?#$y??()*$,$.?0?2?‰!)<??t@_`abc?_`abc?—_`abc?_`abc?_`abc?_`abc?—??$fi8? ??,ofl?flfiffi?—+,???‰?—*“1?—*“1?*“1fi8?^??d?^?^??d?^?^d?^5fl"§$T*A—T*A—3}??€%—?2?fl*OPQRSflA?<??2T??VtA?<??3T

}$????1T2\$]?2T2g?f??2?fif???}$????1T2§ktl??8T8?oEpfi]??T8y$z{?3T1}$????1T2?oEpfi]??T8"§/fl4C1C14C1C112C1C1v;?+,?flfiM<a????flfiM<a????flfiM???fl(y*???y$???y$???y$%&FflFflFfl"§$A?<??DE"§$f??DE"§$r$DD)tu$2$2~?#$y??()*$,$.?0?2?‰?#$y??()*$,$.?0?2?‰!)<??t@?dfiYfg?ifi8ono?qrsuffir—??fg??flz?,4¤z?XY?d?Y?d—??fg??flz?,4¤z?XY?d?Y?d—?Y?d—??????????????????—+,???‰?*“11—*“1?—*“12*“1?—*“1fi8?cw?c?c??w?c?c??w?c?cw?c?c??w?c5fl"§$?`a%—?flflT*A—?flflT*A—?flflT*A—?flflT*A——?2?fl*N$PQ?3R1}$????1R2?XYZfi\??R84fifl?4R2‰?fl?4??%fl?3R24fifl?4R2‰?fl?4??%fl?3R2??%fl?3R2}$????1R2??%fl?3R2‰?fl?4??fl?

R’}$????1R2"§/fl2C1C1K;?4C1C14C1C14C1C14C1C1+,?flfiJ???flfiJ<a????flfiJ<a????flfiJ???flfiJ<a????fl(y*???y$???y$???y$???y$???y$%&CflCflCflCflCfl"§$wABx$z‰=¤?€:¤?€EABz‰=¤?€AB??????}AB)fl??Y"§$$$2?#$y??()*$,$.?0?2?‰?#$y??()*$,$.?0?2?‰!)<??t@fi$[\]$_tfl4¤?e fihizkl?t$9T%p$[\]tfl?l?l?t$aT%p—?[fih??4¤e?y?l??a$$?%tfl—fi$[fih??4¤?e—?l?[tfl?t$—??yfl%??$—zk?[?lfi??yazk—$?fi??p ??[??[?l—+,???‰?*“1?*“1?*“1’—*“1’*<?fi8?X??i?X?Xi?X?Xi?X?X??i?X?Xi?X5fl"§$W%——T*A—T*A—T*A——T*A—?2?fl*2ST%?‰V?

r‰V?2}$????1€??t‰‰???2}$????1$[3fl?1€??t‰‰???2?$V?2??[}fiV???3$?}fiV?9}$????1?2}$????1?2$????fl?8?4?$V?2?2"§/fl4C1C1fi?"§4C1C14C1C14C1C14C1C1+,?flfiN<a????flfiN??????flfiN???flfiN<a????flfiN???fl(y*???y$???y$???y$??????????%&GflGflGflGflGfl"§$ABfla3’A%EFx$fl{|}fiEF)P31AEF???????EF)$$2?#$y??()*$,$.?0?2?‰?#$y??()*$,$.?0?2?‰!)<??t@y$lmn C?pa?p?q$rfiay$lmn ?pqfirfi—??p?q$p?€~p??—??p?q$p?€~p??—?Jtfl4¤??pflz?—+,???‰’—*<?’*“1’*“1’*“1fi8?i??v?i?iv?i?iv?i?iv?i5fl"§$T*A—*DA—*DA—TR*—?2?fl*}$????1a2$?cdefl?8a4g$h?2a2z{|’a3~€9a4}$????1a2??pLfih??a8z{|’a3~€9a4}$????1a2??pLfih??a8fi??fl?@"a?9gT?fl?2??‰h?8"§/fl4C1C18C1C?Q8C1C?Q4C11fi?"§+,?flfiZ<a????flfiZ???flfiZ???flfiZ???fl(y*???VW???VW???VW???VW%&RflRflRflRfl"§$ABC???F$$IJLfiNsPQ)flxyLfiNPQ)????PQg?%??av?@e?e??$*"§$$$2?#$y??()*$,$.?0?2?‰?#$y??()*$,$.?0?2?‰!)"?#$67,$.?0?2?‰<??t@?[fi]??`?t$d??`efgE`?[fiefg—?`?[—??`?[?t$?efg—+,???‰’—*“1’*“1’*“1fi8?Z??q?Z?Zq?Z?Zq?Z5fl"§$T*A——?%—T*A—?2?fl*UVzXfl?3h$zXfl?2j3}$????1j2§}~€?4j4?€?’j3}$????1$???vfl?8?E`?fi???"§/fl

C1C14C1C1fi?"§4C1C1+,?flfiS<a????flfiS???flfiS???fl(y*???OP???OP???OP%&KflKflKfl"§$$BCDE:¤HIJ)uv@vIJ)???????fi???IJ–)+,???‰??2??2??2fi8q?Zq?Zq?Z??OP"§$T*A?%T*A?2?fl*?????fl??<??2j?§}~€?4j4$????$a??fi?%??4j8"§/fl4C1C14C1C14C11+,?flfiSflfiSflfiSfl(y*??????????????????%&?fl?fl?fl"§$??sr?s}?fl?)?flu2Cv?"§$)?$$sfl*)$2$$2$3"?$%&'($*?,?.?‰"?$%&'($*?,?.?‰!)+,???‰WX2WXWX2T?fi?%flfiWX2WX2T?fi?%flfiWXWXWX2WX2fi:U?VU?VU?VU?VU?VU?VU?VU?VU?V5?78"§$T*AT*A+??de%T*ArflflT*Ae%e%*DATR*?2?fl*?OPQfiS??T8_$ab?3T1}$????1?OPQfiS??k$znfl?2z{%fl?3T2}$????1?OPQfiS??k$znfl?2fln??2fln??2???’fi??fl?@"a?9"§/fl4C1C12C1C,\;?4C1C14C14C1C1?C1Cfi?8C1Cfi?

C1C?Q4C1Cfi?+,?flfiMflfiMflfiMflfiMflfiMflfiMflfiMflfiMflfiMfl(y*F???J?F???J?F???J?F???J?F???J?F???J?F???J?F???J?F???J?%&BflBflBflBflBflBflBflBflBfl"§$>?@{Bfl?)fi?fl?g§fl?)rflflu?$$xfl}$$x}~fl?)fl"§$}$$?}$$Qfi??sfl)@z@s?Bfl"§$$$3?#$%&'$)?+?-?‰9?#$%&'$)?+?-?‰9=??tAfiaYca?d,y$ca%h—?dofi$a—fi$a??$tfl4¤??fi?Zz??d,?t$?%h—*+???‰flk

Tflk

Tl$mn?flT*A3x??tu%yk

Tflk

Tfl??flaA%??k

Tflk

Tfi9Z?[2??4?[fi)Z?[Z?[4?67!§#T*AT*A+??tu%T*AT*A+??tu%—?1?fl*NOPQDflB?=??2S?}$????1S2X$Y?2S2l$mn?3S1?paqfiY??S8}$????1S22??%?‰Y?

}$????1!§.fl

C1C12C1C1i;?!§4C1C1*+?flfiM???flfiM???flfiM???fl'y)???D????D????D?$%GflGflGfl!§#B?D?fl?)1fl?}$$$?}?fl?)$$4?#$%&'$)?+?-?‰?#$%&'$)?+?-?‰!)y2>??tB?f?m?tJ?qrs—?mfifhz},$~—?mfifhz},$~—?m~ftlt$—??y%??$—z}—+,???‰flk

Tflk

Tflk

Tflk

Tflk

Tflk

Tfl1k

Tflk

Tfi:h?ih?ih?ih?i5?78"§$T*AT*AT*AT*A?2?fl*}$????1$[\??$a??fi`%bc4?efEfig??$[\??$a??fi`%bc4y8}$????1y2z$g?2y2$[\??$a??fi`%bc4y8}$????1y2z$g?2y2?efEfig??y8}$????1"§/fl4C1C12C1C14C1C14C1C1+,?flfiU???flfiU???flfiU???flfiU???fl(y*???R????R????R????R?%&NflNflNflNfl"§$CEfiGHIJ?fl?Efl?)?uvwflHR?N)a€w??@R?N)?flflfl?$$4?#$%&'$)?+?-?‰?#$%&'$)?+?-?‰!)>??tB?hijfi\zmfl¤?—\?h`??m???—?hfi???\,?t$???\???—fi\Y??\bzm?h—?hfi\??fi?\—+,???‰flC$*efk

Tflk

Tfl~?$fl??\"§$k

Tflk

Tflk

Tflk

Tflk

Tflk

Tfl3k

Tflk

Tfi:b?cb?cb?cb?cb?c5?78"§$T*AT*AT*AT*AT*A?2?fl*fi$T$UV‰÷??4?[\]fi_??`8a$_?2`2~?t?fl??`4a$_?2`2??z?fl?3}$????1`2?????2?[\]fi_??`8}$????’9a$_?2`2"§/fl4C1C11

C1C11fi?"§4C1C1+,?flfiQ???flfiQ???flfiQ???flfiQ???flfiQ???fl(y*???N????N????N????N????N?%&JflJflJflJflJfl"§$JC$$r$sF?t$$wflfl#|}*1)t?w}?:¤?}fl????N?fl?C$fl?)$4$44C?C?C1C?#$%&'$)?+?-?‰!?#$%&'$)?+?-?‰!)?#$0$23'$)?+?-?‰>??tB?bfiZ?egZ—fiZzl?b—fi$Wv$Zetfl$z%fll|)—+,???‰fl3k

Tflk

Tflk

Tflk

Tflk

Tflk

Tfi:^?_^?_^?_5?78"§$T*AT*AT*AT*A?2?fl*}$????’9}$????1W2?YZ[fi]??W8j?i??2?YZ[fi]??mnot‰‰t??2}$????1"§/fl4C1C114C1C1+,?flfiQ???flfiQ???flfiQ???fl(y*???N????N????N?%&JflJflJfl"§$C$@fifl?i??N?J)N?J+,???‰?? %?fl}?s?3??flflfi)fi:^?_5?78"§$T*A?2?fl*}$????1W2$???€fl?8W4?$]?2W2"§/fl4C1C1+,?flfiQ???fl(y*???Jfl78%&Jfl"§$$~$€??$$?fl?)$4$4?C1C$??#$%$'()$+?-?/?‰?#$%$'()$+?-?/?‰!)23)$+?56)$+?-?/?‰+,???‰]^ %afl}c?3]^flflfiS]^ghflfifl§a]^ %afl}c?3]^flflfi)fi:[?\[?\5?78"§$T*AT*A?2?fl*}$????1S2$?UVWfl?8S4Y$Z?2S2}$????1S2Y$Z?2S2"§/fl4C11?C2C1+,?flfiM???flfiM???fl(y*???Ffl78???Ffl78%&FflFfl"§$>?@AB?fl)fl?+,???‰?$"§vw?x8flfl

?$"§vw?x8flfl

?$"§vw?x8flfl

?$"§vw?x8flfl

fi:?\?\?\?\5?78"§$T*A|flfl?%?%?2?fl*}$????1S2?rstfiZ??S8~%fl?3S2§a????4S4§a????4S4?$/fl

C??1

C??1

C??1

C2+,?flfiMflfiMflfiMflfiMfl(y*op"§$op"§$op"§$??"§$%&FflFflFflFfl"§$lW?mF)|flfl~F$$?flm$|flfl~F$?$4$?$4";$$&??)??-?/?‰";$$&??)??-?/?‰*+???‰flfi$[§]fl§_flQflfi$[§]§_flDflfi$[fl§]fl§_fl`flfi$[fl§]fl§_fl`flfi$[!§#qoflfifl$Lflfi!§#flqpflfi$[!§#qv?pflfi$[!§#qxp?!§#qop?!§#flqpUp)flfi$[@Aq???qxflfi$[@Aa???qxflfi$[fl§]fl§_flQflfi$[§]§_fl`flfi$[fl§]fl§_flDflfi$[fl§]fl§_fl`?!§#q?xp?!§#fipL?xpfi5???????????????1?fl*}$????1L2$MN??$a??Q?S??2TUVWX?1L3htj??’$?S??2‰tqu?’}$????1L2}$????1L2$?S??2??%fl?3L2??fl?

L’fi$?$h?‰÷??4$MN??$a??fi?%??4L8Q?S??2@]sh?E??1htj??’$MN??$a?fi?%??1!§.fl4C1C14C1C14C1C14C1C14C1C14C1C14C1C1*+?flflE?flflE?flflE?flflE?flflE?flflE?flflE?fl'y)‰?‰?‰?‰?‰?‰?‰?$%>?@@A@A@A>?@>?@?fl!§#÷:fl<=)??cde?!§#?r<=)ye?z$1|flfl÷:fl<=?$t??:?‰#?D??:$$’s!§#)";$$&??)??-";$$&??)??-?/?‰!+,???‰?TU>$+2V?X?TU>$+2ZXflfi$l"§$mnflflfiphflfi$l"§$mnflfi$l"§$mnflfi$l"§$qZflflfi"§$flqXflfi$lTUR2 1T"§$q?&TU$@a2@2

1?@xflV?Xflfi$lTUR21T"§$flqX&TUP$@?1a2@2,

1?@xV?X?"§$qZ?"§$?Xflqfi6?????????????2?fl*}$????1M2§OtQ??8M8‰^q`?’$ab??$a?fif%hi1‰^q`?’$ab??$a?fif%hi1$ab??$a??fif%hi4M8z?|??2}$????1M2§OtQ??8M8?????fl??F??2M?$ab??$a?fif%hi1"§/fl4C1C14C1C14C1C14C1C14C1C14C1C1+,?flflF?flflF?flflF?flflF?flflF?flflF?fl(y*‰?2?2‰?‰?‰?‰?2?2‰?%&@fl@fl@flwx@fl@fl"§$$$<fl$+2?)[fl$"§$)[fl$?r"§$)sfiu¤"§$}sfiu$$<fl$$?aP2????u??s$$’";$$&??)??-";$$&??)??-?/?‰!+,???‰?"§$q_?"§$abflq?"§$oab?"§$o_b?"§$oab?"§$o_bflfi$?"§$o_b?"§$oab?"§$o_bfi6???????????2?fl*WflYfl?

gTYfl?2$st??$a??fiz%|}4~8‰€q??’$st??$a??fiz%|}4~8‰€q??’fl??@$f?hi ???2?fl??$st??$a??fiz%|}4~8‰€q??’"§/fl4C1C14C1C,1?§?Pfl§mno"§$$q4C1C,1?§?Pfl§mno"§$$q4C1C,1mno"§$$q4C1C,1?§?Pfl§mno"§$$q+,?flflU?flflU?flflU?flflU?flflU?fl(y*‰?‰?‰?‰?‰?%&PflPflPflPflPfl"§$:;<=s?‰=;<=s@z;<=s$EF<=sfl§s<=s?KF<=s? ?;<=s?as<=s?@f?hi"§$?@f?hi2"§$@$f?hi??–@f?fl?i"§$$’$’";$$&??)??-";$$&??)??-?/?‰!+,???‰flfi$a"§$ocd?qr‰<?‰ 2 $2C?2q3q"§$q??d?qr‰<?‰ 2 $2C?2q3q"§$flqd?"§$qc?"§$flqd?"§$qcd?"§$?dflq?"§$qcd?§$?dflq?"§$ocd?"§$?dflq?"§$ocd?"§$?dflqfi6???????????????2?fl*$ST??$a??fiZ%\]4^8Mizkfl?3m?flfifl?1}$????1^2@?s?mH??1}$????1^2‰?q??’?t???’?????fl??H??2^?‰?q??’$ST??$a??fiZ%\]4^8?t???’}$????1^2"§/fl4C1C,1?§?Cfl§MNO"§$$Q

C1C14C1C14C1C14C1C14C1C14C1C1+,?flflH?flflH?flflH?flflH?flflH?flflH?flflH?fl(y*‰?‰?‰?‰?‰?‰?‰?%&CflCflCflCflCflCflCfl"§$@<?fl?@?B‰<?fl?}fi€?s$??€?s$€?s?€?s?‰=€?s$$’";$$&??)??-";$$&??)??-?/?‰!+,???‰?"§$oZ[?"§$?[flq?"§$qZ?"§$flq[?"§$qZ[?"§$?[flq?"§$oZ[?"§$?[flq?"§$oZ[?§$?[flq?3=>fl=>flfi$???flflfi?Pflfi$???flfi$???fi6??????????????flfi%?"§@1?????2?fl*$HI??$a?fiN%PQ1RSTUV?1W’dtf??’$HI??$a?fiN%PQ1dtf??’$?n??2dtf??’‰rqs?’}$????1W2|?n??2§?????4W4}$????1W2‰?fl?4??%fl?3W2??%fl?3W24fifl?4W2"§/fl4C1C14C1C14C1C14C1C14C1C14C?C21fl?1???4C1C14C1C1+,?flflE?flflE?flflE?flflE?flflE?flflE?flflE?flflE?fl(y*‰?‰?‰?‰?‰?‰?‰?‰?%&@fl@fl@fl@fl@fl@fl@fl@fl"§$@z<=>sfl§s=>s?ij=>sp<¤@uv$2x}fl$€"§$fi??fl?flfl?fl$$’";$$&??)??-";$$&??)??-?/?‰!+,???‰flfi$PQRflflfiTUflfi$PQRflflfiTUflfi$PQRflflfiTU?"§$qab?"§$?bflq?"§$qsb?"§$qabflfi$P"§$qabflfi$P"§$qabfi6?????????????2?fl*EF%fl?3I2JflKLM?4EF%fl?3I24fifl?4I2FXfl?

I’EF%fl?3I2EF%fl?3I2‰]q_?’EF%fl?3I2‰]q_?’EF%fl?3I2‰]q_?’"§/fl4C1C14C1C14C1C14C1C14C1C,1?§??fl§nop"§$$r4C1C1+,?flflC?flflC?flflC?flflC?flflC?flflC?fl(y*‰?‰?‰?‰?‰?‰?%&?fl?fl?fl?fl?fl?fl"§$:flfl=fl:flfl=fl:flfl=fl:flfl$Z[:flfl?@gij:flfl@$gij?u$$’";$$&??)??-?";$$&??)??-?/?‰!+,???‰?"§$q?ST?"§$?TflqR2b?cdR2 1c"§$ogTR2b?cdR2 1c"§$o?T;P2b ?cd41$@t212@"§1"§$flqTP2b ?,cd41$@t212@"§1"§$o?T?"§$qgT?"§$?Tflqflfi$?"§$??flflfi"§$?x?fl?ˉfi?ˉ?$++?fl?ˉfi?+?$+ˉ?fl?flfi??zfi?flfifi6?????????????2?fl*HtJ??’MaqP??§[tJ??8\8]^%fl?3\2^afl?

\’}$????1\2$rs??$a?fiw%xy1$?z{|fl?8\4}$????1\2}$????1\2$rs??$a?fiw%xy1??z?fl?3?%z?fl?

\4"§/fl4C1C14C114C1C14C1C14C1C1

C11+,?flflE?flflE?flflE?flflE?flflE?flflE?fl(y*‰?‰?‰?‰?‰?‰?%&@fl@fl@fl@fl??fl??fl"§$?as=>sXflflP"§$lm=>"§$?z{|?fl?Tfi?"§$fi?"§$$$’?-?/?‰!)";$$&??-?/?‰!)";$$&??)?))+,???‰2C8CoO&2Co<&%Rb<%Rflb<?n?t$z:"§$?U$Dqw?n?tx$z:"§$$Dqw?zfi?flfi?‰~?‰ 2 $2O?2?q?U?zfi?flfi?‰~?‰ 2 $2O?2?flqUfl?flfi?‰~?‰ 2 $2O?2?q?U?n?t$?z:9?%?fi?%?n?t$9?%??n?t$a?%?fi6????[?"§~?_?2?flfl?2~3)??????A?[?????[??2?fl*CDEFG?1H’}$????1H2?TUVfiX??H8$?VfiX?9ijzlfl?3}$????1H2§?????4H4??flfifl?1}$????1H2??%fl?4H’??%fl?3H2?TUVfiX??H8?‰X?2"§/fl4C1C14C14C1C14C1C14C1C14C1C1+,?flflA?flflA?flflA?flflA?flflA?Aa?fl(y*‰?‰?‰?‰?‰?‰?%&<fl<fl<fl<fl<fl<fl"§$:;"§$P%Rd$$ghyfi‰~?"§$fi?%gh%gh????fla%gh$$’";$$&??)??-?";$$&??)??-?/?‰!)?V?t$aZ%[+,???‰?V?t$9Z%[?"§$qq?"§$flqt?fi?fi?$?fi‰???tQ%?fl‰???tfl%?fl?§fl???fi??§fl?{fi??tY??t?flqt?"§$qq?"§$flqt?"§$q??"§$flqtfi6??RST????????????????2?fl*IJzLfl?3O‰Q?2b?tffl??g4fi$j$Ok‰÷??4}$????’9}$????1g2?qt?fiQ??g8}$????1g2?????fl??F??)2g??$Q?2g2??????1g’}$????1g2$????$a??fi?%??4$????$a?fi?%??1§?t???8g8‰?q??’"§/fl4C1C14C1C14C1C1———4C1C14C11+,?Fa?flflF?flflF?flflF?flflF?flflF?flflF?flflF?fl(y*‰?‰?‰?2?22?22?2‰?‰?%&Cfl_fl_fl_fl_fl??_fl_fl"§$:;<}>?%AB)\=^$v$wx?:$$<fl*–1*T)‰??t_?fl?2fl$???sf=xfl"§$$$’";$$&??)??-?";$$&??)??-?/?‰!)+,???‰flfi$Vflflfiflflfi?jkfl÷`221fl4