T-SHRH 022-2019 化妝品保濕功效評(píng)價(jià) 體外重組3D表皮模型 測(cè)試方法

71.100.70C2682Y42

T/SHRH

022-2019________________________________________________________________________________________

Moisturizing

test

cosmetics

In

reconstructed

skin

test

T/SHRH

022-2019 前言…………… 21

32.

規(guī)范性引用文件………… 33.

術(shù)語(yǔ)和定義……………… 34.

試驗(yàn)原則………………… 35.

試劑及儀器設(shè)備………… 36.

試驗(yàn)步驟………………… 47.

結(jié)果計(jì)算………………… 58.

結(jié)果判定………………… 5附錄

A

資料性附錄……………

6附錄

B

資料性附錄……………

7T/SHRH

022-2019 本標(biāo)準(zhǔn)按照

GB/T1.1-2009

給出規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由上海日用化學(xué)品行業(yè)協(xié)會(huì)提出和歸口。本標(biāo)準(zhǔn)的某些內(nèi)容可能涉及專利，本標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。公司、上海創(chuàng)元化妝品有限公司、福建片仔癀化妝品有限公司、東阿阿膠股份有限公司、上海綠瑞生物科技有限公司、云南貝泰妮生物科技集團(tuán)股份有限公司、上海天祥質(zhì)量技術(shù)服務(wù)有限公司、上海日用化學(xué)品行業(yè)協(xié)會(huì)。謝阿貴、廖峰、姜春鵬、趙奕竹、馬驍、王飛飛、李瓊、金堅(jiān)、陳亦華。T/SHRH

022-2019化妝品保濕功效評(píng)價(jià)

體外重組

表皮模型測(cè)試方法1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了一種基于體外重組

表皮模型的化妝品原料及化妝品成品的保濕功效測(cè)試方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于具有生物學(xué)深層保濕作用的化妝品原料及成品的保濕功效測(cè)試，不適用于吸濕劑、封閉劑類化妝品。2 規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件，凡不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682

分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法化妝品安全技術(shù)規(guī)范3 術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。體外重組

表皮模型

reconstructed

采用人原代表皮角質(zhì)形成細(xì)胞，通過(guò)組織工程技術(shù)在體外重組的皮膚組織，具有與正常皮膚高度相似的復(fù)層化結(jié)構(gòu)、生理及代謝功能。4 試驗(yàn)原則4.1

3D

表皮模型（EpiKutis?），具有表皮的復(fù)層化結(jié)構(gòu)（基底層、棘層、顆NMF關(guān)。4.2

生物學(xué)深層保濕是通過(guò)一系列的生物化學(xué)作用，提升角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)天然保濕因子含量，達(dá)到提升皮膚保濕功能的作用。吡咯烷酮羧酸(

PCA)與尿刊酸（Urocanic

acid，）是

NMF

的重要組成成分，通過(guò)對(duì)

PCA、UCA

的含量分析，可以評(píng)價(jià)皮膚生物學(xué)深層保濕功能。5 試劑及儀器設(shè)備5.1

材料及試劑5.1.1

體外重組

表皮模型（?）。5.1.2

體外重組

表皮模型培養(yǎng)液（EpiGrowth

培養(yǎng)液）。5.1.3

蛋白酶

K。5.1.4

甲酸銨。5.1.5

甲醇（色譜純）。T/SHRH

022-20195.1.6

乙腈（色譜純）。5.1.7

吡咯烷酮羧酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度

5.1.8

順式尿刊酸標(biāo)準(zhǔn)品（）（純度

）。5.1.9

反式尿刊酸標(biāo)準(zhǔn)品（）（純度

）。5.1.10

磷酸鹽緩沖液（PBS）。5.2

儀器和設(shè)備5.2.1

超凈工作臺(tái)。5.2.2

培養(yǎng)箱：15±1%CO，95%相對(duì)濕度。5.2.3

高效液相色譜儀。5.2.4

低溫高速離心機(jī)。5.2.5

氮?dú)獯蹈蓛x。5.2.6

超聲波振蕩儀。5.2.7

超純水儀。5.2.8

旋渦震蕩儀。5.2.9

分析天平(精度

。6 試驗(yàn)步驟6.1

體外重組

3D

表皮模型的準(zhǔn)備該步驟在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。每輪測(cè)試中，空白對(duì)照組和各待測(cè)物組均需要

1

塊

6

孔板，3

外重組

6

孔板，在每個(gè)

6

孔板的第一排孔中各加入

EpiGrowth

培養(yǎng)液。將模型轉(zhuǎn)移至

6

孔板中，置于

培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37±15±1%

CO、95%相對(duì)濕度）。6.2

給藥

25μL后，將

6

培養(yǎng)箱中，孵育培養(yǎng)

24h（37±1℃、

CO、相對(duì)濕度）。6.3

清洗模型孵育培養(yǎng)結(jié)束后，開(kāi)始清洗程序。用無(wú)菌

PBS

溶液重復(fù)清洗模型表面

次，去除殘留的待測(cè)物。6.4

角質(zhì)層

NMF

提取4將體外重組

表皮模型用刀片沿邊緣環(huán)切后，轉(zhuǎn)移至

離心管中，并在每管中加入

500μL4蛋白酶

K

工作液（濃度

），置于恒溫培養(yǎng)箱，50℃酶解

。用鑷子夾取角質(zhì)層，置于新的1.5mL

μL

離心管放入低溫高速離心機(jī)，4℃

14000rpm

離心

μL

℃12000rpm

，吸取

194μL

上清液到內(nèi)襯管中，加入

5μL

1M

甲酸銨母液及

2.5μL

乙腈震蕩混勻，待上機(jī)。6.5 測(cè)定條件6.5.1

吡咯烷酮羧酸（PCA）高效液相色譜測(cè)定條件如下：a)

色譜柱：C18

柱，5μm，。T/SHRH

022-2019b）流動(dòng)相：

甲酸銨溶液（）加入

10mL

乙腈，攪拌均勻，0.45μm

混合過(guò)濾膜過(guò)濾，超聲

。c）柱溫：d）流動(dòng)相流速：。e）進(jìn)樣量：40μL。f）檢測(cè)波長(zhǎng)：210nm。g）出峰時(shí)間：。6.5.2

尿刊酸（UCA）高效液相色譜測(cè)定條件如下：a)

色譜柱：C18

柱，5μm，。b）流動(dòng)相：

甲酸銨溶液（）加入

10mL

乙腈，攪拌均勻，0.45μm

混合過(guò)濾膜過(guò)濾，超聲

。c）柱溫：d）流動(dòng)相流速：。e）進(jìn)樣量：40μL。f）檢測(cè)波長(zhǎng)：270nm。g）

出峰時(shí)間：cis-UCA

出峰時(shí)間：。6.6

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制按

6.5

色譜條件檢測(cè)吡咯烷酮羧酸（PCA）、尿刊酸（、）標(biāo)準(zhǔn)品，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖參見(jiàn)附錄

A

B。6.7

按色譜條件

對(duì)待測(cè)物進(jìn)行測(cè)定，并根據(jù)待測(cè)物峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各待測(cè)物中

PCA、cis-UCA、

的含量。6.8

質(zhì)量控制a) 高效液相色譜儀對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定量測(cè)定時(shí)，需確認(rèn)目標(biāo)物的保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)品相一致。b) 高效液相色譜儀檢測(cè)需要設(shè)置空白試驗(yàn)。7 結(jié)果計(jì)算目標(biāo)物的總含量=目標(biāo)物測(cè)定濃度×總體積。UCA

總含量=

+trans-UCA

含量。8 結(jié)果判定以下條件說(shuō)明待測(cè)物具有保濕功效:與空白對(duì)照組相比，待測(cè)物

PCA

含量顯著上升，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異；與空白對(duì)照組相比，待測(cè)物

含量顯著上升，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異；如待測(cè)物只滿足上述部分條件，仍可說(shuō)明待測(cè)物具有保濕功效。T/SHRH

022-2019附

錄

A（資料性附錄）A.1

PCA標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖A.2

標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖A.3

標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖T/SHRH

022-2019附

錄

B（資料性附錄）標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制及上機(jī)前預(yù)處理1.

PCA

標(biāo)準(zhǔn)品的配制用分析天平稱取

PCA

標(biāo)準(zhǔn)品

，放入

離心管中，加入

去離子水，旋渦震蕩混勻，

1000

度梯度分別為

、4μg/mL、1μg/mL、0.25μg/mL、0μg/mL。2.

標(biāo)準(zhǔn)品配置2.1

用分析天平稱取

標(biāo)準(zhǔn)品

，放入

1.5mL

離心管中，加入

1mL

去離子水，旋渦震蕩混勻，即為標(biāo)準(zhǔn)品母液（）。采用去離子水對(duì)母液進(jìn)行

1000

倍稀釋，并依次配制標(biāo)準(zhǔn)品工作液，濃度梯度分別為

μg、0.6μg、0.15μg、0.0375μg、0μg/mL。2.2

用分析天平稱取

標(biāo)準(zhǔn)品

，放入

1.5mL

離心管中，加入

去離子水，旋渦震蕩混勻，即為標(biāo)準(zhǔn)品母液（）。采用去離子水對(duì)母液進(jìn)行