豬傳染性胃腸炎病毒膠體金免疫層析試紙條的研制的開題報(bào)告

豬傳染性胃腸炎病毒膠體金免疫層析試紙條的研制的開題報(bào)告一、研究背景及意義豬傳染性胃腸炎（PorcineEpidemicDiarrhea，PED）是一種由豬傳染性胃腸炎病毒引起的急性胃腸炎癥，導(dǎo)致豬嶄瀉、嘔吐、消瘦，尤其是對(duì)幼豬的危害更為嚴(yán)重，經(jīng)常造成大量的豬只死亡。2013年至2014年P(guān)ED在中國(guó)迅速傳播，給我國(guó)畜牧業(yè)和經(jīng)濟(jì)帶來了嚴(yán)重的損失。因此，如何及早發(fā)現(xiàn)PED的感染情況，對(duì)于保障養(yǎng)豬業(yè)生產(chǎn)、實(shí)現(xiàn)養(yǎng)豬業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。目前，PED的診斷主要以病原學(xué)檢測(cè)為基礎(chǔ)，包括病毒抗體檢測(cè)和核酸檢測(cè)。PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR、細(xì)胞培養(yǎng)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等被廣泛用于PED的檢測(cè)，但由于這些方法需要高昂的設(shè)備和專業(yè)人員，不利于現(xiàn)場(chǎng)快速診斷，因此需要開發(fā)一種簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、敏感和特異性較好的PED檢測(cè)方法?，F(xiàn)有的研究表明，利用膠體金技術(shù)和免疫層析技術(shù)結(jié)合，可以制備出一種簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、敏感和特異性較好的PED檢測(cè)方法，包括PED膠體金免疫層析試紙條。這種試紙條不需要顯微鏡觀察，只需要通過肉眼觀察檢測(cè)結(jié)果即可，能夠滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求。因此，本研究擬開發(fā)PED膠體金免疫層析試紙條，以期提高PED的診斷水平，為養(yǎng)豬業(yè)提供更好的保障。二、研究?jī)?nèi)容及方法1.PED病毒抗原的克隆和表達(dá)：通過PCR擴(kuò)增PED病毒N基因，并將其克隆到表達(dá)載體pET28a(+)中，利用大腸桿菌表達(dá)PED病毒N基因。采用親和層析和SDS等方法提取純化重組蛋白；2.PED膠體金免疫層析試紙條的研制：將制備的PED病毒N蛋白標(biāo)記在膠體金顆粒表面，制備PED膠體金。將制備的PED膠體金涂覆在膜的測(cè)試線位，根據(jù)PED病毒N蛋白的特異性，將抗PED病毒的單克隆抗體固定在紙條的測(cè)試線位上。同時(shí)，將抗雞IgG的單克隆抗體固定在控制線位上。制備PED膠體金免疫層析試紙條。3.PED膠體金免疫層析試紙條的性能評(píng)價(jià)：測(cè)量PED膠體金免疫層析試紙條的檢測(cè)限、特異性和靈敏度；通過實(shí)驗(yàn)比較PED膠體金免疫層析試紙條和PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR等方法的檢測(cè)結(jié)果并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，評(píng)價(jià)PED膠體金免疫層析試紙條的準(zhǔn)確度、去假陽(yáng)性率和去假陰性率等。三、預(yù)期結(jié)果1.成功克隆和表達(dá)PED病毒N基因，制備出PED病毒N蛋白；2.研發(fā)出PED膠體金免疫層析試紙條，在性能評(píng)價(jià)中取得較好的檢測(cè)限、特異性和靈敏度；3.通過與PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR等方法比較，證明PED膠體金免疫層析試紙條具有較好的準(zhǔn)確度、去假陽(yáng)性率和去假陰性率；4.為PED的快速診斷提供了一種簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、敏感和特異性較好的檢測(cè)方法，為我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)提供更好的保障。四、研究經(jīng)費(fèi)本研究的經(jīng)費(fèi)主要用于病毒抗原克隆和表達(dá)、試紙制備、試紙性能評(píng)價(jià)以及試紙?jiān)赑ED檢測(cè)中的應(yīng)用等方面，總經(jīng)費(fèi)預(yù)計(jì)為XX萬(wàn)元。五、研究時(shí)間本研究的預(yù)計(jì)時(shí)間為XX個(gè)月。六、研究人員及分工1.分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)：X、X、X等；2.免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)：X、X、X等；3.測(cè)定和數(shù)據(jù)分析：X、X等。七、研究進(jìn)度計(jì)劃1.第1-6個(gè)月：病毒抗原克隆和表達(dá)，制備出PED病毒N蛋白，并制備出PED膠體金；2.第7-10個(gè)月：試紙制備，制備出PED膠體金免疫層析試紙條；3.第11-14個(gè)月：性能評(píng)價(jià)，通過實(shí)驗(yàn)證明PED膠體金免