SN 1675-2005魚真鯛虹彩病毒聚合酶鏈反應(yīng)操作規(guī)程

中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)魚真鯛虹彩病毒聚合酶鏈反應(yīng)操作規(guī)程Protocolofpolymerasechainreaction(PCR)forredsea-breamiridovirus(RSIV)offish2005-09-30發(fā)布國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局I本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A為規(guī)范性附錄，附錄B為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由國(guó)家認(rèn)證認(rèn)可監(jiān)督管理委員會(huì)提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)為首次發(fā)布的出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。11范圍2規(guī)范性引用文件24.3微量移液器及吸頭。4.4紫外觀察燈。4.5恒溫培養(yǎng)箱。4.6普通冰箱和低溫冰箱。4.7勻漿器。4.8離心機(jī)和離心管。5取樣和制樣對(duì)魚的解剖采樣，如果是體長(zhǎng)小于4cm的魚苗取整條魚，體長(zhǎng)4cm～6cm的魚苗取內(nèi)臟(包括的規(guī)定采樣。在15℃條件下，在1.5mLEppendorf管中首先加入25mg～100mg組織，加入150μLCTAB溶后置于25℃作用2h。6.1核酸抽提首先加350μL抽提液1(見第A.2章),充分混合至少30s;12000r/min離心5min,取上層水相；再加350μL抽提液2(見第A.3章),充分混合30s;12000r/min離心5min,取上層水相；然后加入1.5倍體積的-20℃無(wú)水乙醇，混勻后，-20℃放置6h以上；15000r/min離心30min,小心倒去上清將反應(yīng)管置于PCR擴(kuò)增儀。94℃變性4min;94℃變性1min、58℃退火1min,72℃延伸1min,35次循6.3設(shè)立對(duì)照6.3.1在6.1中的樣品處理過(guò)程中必須設(shè)立陽(yáng)性樣品對(duì)照、陰性樣品對(duì)照、空白對(duì)照，6.3.2取含有已知RSIV的病毒懸液或核酸作為陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照物由國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局指定單位提供。6.3.3取正常的魚組織抽提核酸作為陰性對(duì)照。6.3.4取等體積的水代替模板作為空白對(duì)照。6.4瓊脂糖電泳用TBE(見第A.6章)電泳緩沖液配制1.5%的瓊脂糖(含1μg/mLEB,見第A.7章)平板。將平板放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好淹沒(méi)膠面。將6μL樣品和溴酚藍(lán)指示劑溶液(見第A.8章)按比例混勻后加入樣品孔。在電泳時(shí)使用核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物作對(duì)照。5V/cm電泳約0.5h,當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)底部時(shí)停止。37.1在紫外燈下觀察核酸帶并判斷結(jié)果4加巰基乙醇到終濃度為0.25%。A.2抽提液125:24:1的比例混合，密閉避光保存。TritonX-100用5.0mol/I的鹽酸調(diào)pH到8.0。用水配制成10.0mg/mL的濃縮液。用時(shí)每10.0mL,電泳液或瓊脂中加1.0μL,5(資料性附錄)1GTGACTGCACACCAATGGACGTGGTCGACAAGGTGTATGTCATTCCAGATGGTGGCTGTGACTCGGATGTGGTGTCCCCTTCGTCATATACGGGCGCGTATGTGTATGAGGCGTGTACAACCCATGGACTTCCAGAGTCTGTATCCGAGTATTATCATATCCAAGAACATATGCTACAGCACCTTGGTAGCTGCGAACACGACCCACAGTGGCGTCGAGATTGGTGTCTTGCAATGTAACATGGCAGCGCTTCCGCGACGCGCCACCCAAGGATGCGTGAGAAATGAAGATCCAGTACGCAAGCATGACACCCTCGGTGGTTAAGTGTAACGTCTTCAGCTTCAGGTTCACGAAGGCGTGCTGCCACGGGTGCTGCGTAACCTGCTGGAGAGCAGGGCCCGCGTACGAGCTAGGGCAGTTCTGGACAAGAAGCAGCTGGC