DB1509T 0008-2024馬鈴薯脫毒苗繁育技術規(guī)程

ICS65.020.20CCSB05DB1509Codeofpracticefortheproductionin-vitro烏蘭察布市市場監(jiān)督管理局發(fā)布I本文件按照GB/T1.1-2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的規(guī)定起本文件由烏蘭察布市農牧局提出并歸口。本文件起草單位：烏蘭察布市種業(yè)工作站、內蒙古農業(yè)大學職業(yè)技術學院、烏蘭察布市科學事業(yè)發(fā)展中心、烏蘭察布市產品質量計量檢驗檢測中心、烏蘭察布市財政預算績效評價中心、烏蘭察布市科技創(chuàng)新中心、內蒙古自治區(qū)人工影響天氣中心。本文件主要起草人：趙玉平、牛俊美、劉智慧、崔健、郝帥、戎素平、于國林、何瑞兵、辛悅、郭巖峰、董其冰、姚國宇、朵嵐、黃修梅、王靜、李海青、劉偉、武振亞、王碧春、彭淑淵、閆秀麗。1馬鈴薯脫毒苗繁育技術規(guī)程本文件規(guī)定了馬鈴薯莖尖脫毒與組織培養(yǎng)、脫毒苗繁育技術要求和操作規(guī)程。本文件適用于烏蘭察布地區(qū)的馬鈴薯種薯莖尖脫毒和組培苗的生產。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內容通過文中的規(guī)范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T29375-2012馬鈴薯脫毒試管苗繁育技術規(guī)程GB/T29378馬鈴薯脫毒種薯生產技術規(guī)程3術語和定義下列術語和定義適用于本文件。3.1葉原基ieafprimordium在莖尖生長點的基部形成的突起。3.2莖尖stemtip莖頂端部分（0.1mm～0.3mm），其中包括分生組織及芽原基和正在發(fā)育的葉原基。3.3莖尖分生組織meristem莖部位具有持續(xù)或周期性分裂能力的細胞群。3.4組培苗plantlet馬鈴薯優(yōu)良品種的塊莖，利用莖尖脫毒技術、脫毒苗擴繁技術獲得的，經質量檢測后不帶有馬鈴薯X病毒（PVX）、馬鈴薯Y病毒（PVY）、馬鈴薯S病毒(PVS)、馬鈴薯卷葉病毒（PLRV）、馬鈴薯A病毒(PVA)、馬鈴薯M病毒（PVM）和馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（PSTVd），用于生產原原種的再生苗。4脫毒流程4.1培養(yǎng)基制備4.1.1培養(yǎng)基的配方2莖尖培養(yǎng)基配方符合GB/T29375-2012中附錄B，MS培養(yǎng)基配方符合GB/T29375-2012中附錄C。4.1.2培養(yǎng)基分裝培養(yǎng)基分裝于容器中，用封口膜封口。4.1.3滅菌將盛有培養(yǎng)基的容器置于高壓滅菌鍋121℃滅菌20min，冷卻后在無菌貯存室放置3d～5d,無污染的培養(yǎng)基放到超凈工作臺備用。4.2材料的選擇和處理4.2.1篩選無馬鈴薯紡錘塊莖類病毒的材料。4.2.2在生長季節(jié)選擇具有原品種典型特征的單株材料，收獲并通過休眠后，將薯塊在溫室或培養(yǎng)箱內進行催芽處理。4.2.3對待脫毒材料進行高溫鈍化處理。溫度37℃,處理時間15d?；蛘邔冸x好的莖尖放入生長箱中培養(yǎng)，放入生長箱在25℃下處理20h～21h，之后在40℃下處理4h～5h，其間1500Lx～2000Lx光照12h，黑暗12h，鈍化時間在4w～6w。4.3莖尖脫毒4.3.1莖尖消毒待芽萌發(fā)至2cm～3cm時，選取粗壯的芽，用解剖刀切下，芽段用無菌水沖洗30min，再用75%的酒精浸泡30s，放入無菌杯內用10%的次氯酸鈉浸泡15min，用無菌水沖洗2～3次后放入滅菌后的超凈工作臺中。4.3.2莖尖剝離及接種將經消毒后的莖尖放在無菌濾紙上吸干水分，在40倍解剖鏡下用滅菌的解剖刀、解剖針剝取帶一個葉原基的莖尖（0.1mm～0.3mm），將生長點迅速接種于盛有莖尖培養(yǎng)基的容器中，進行離體培養(yǎng)。4.4莖尖組織培養(yǎng)4.4.1溫度15℃~25℃,光照強度2000Lx～3000Lx，光照時間16h/d，培養(yǎng)120d～140d。4.4.2當看到明顯生長的小莖，葉原基形成可見的小葉，轉入無生長調節(jié)劑的培養(yǎng)基中。4.4.3小苗繼續(xù)生長并形成根系并發(fā)育成3～4個葉片的試管苗。4.5病毒檢測以單株為系進行擴繁，苗數(shù)達150～200株時，隨機抽取3～4個樣本，每個樣本10～15株，進行病毒檢測，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測確認不帶有PVX、PVY、PVS、PLRV、PVA、PVM和往復雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測確認不帶有馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（PSTVd）。4.6性狀檢驗經檢驗不帶病毒的組培苗進行擴繁試種觀察。將每個組培苗取出一部分，將根部培養(yǎng)基清洗干凈后移栽到防蟲網棚，結出的小薯種植到田間試種觀察，檢驗其是否發(fā)生變異，符合原品種特性的典型性狀的脫毒苗即為核心苗。35基礎苗培養(yǎng)器皿表面用75%的酒精擦試消毒，用鑷子取出核心苗，按單莖切段，每個段至少帶一片小葉，腋芽朝上插入MS培養(yǎng)基培養(yǎng)。溫度15℃~25℃,相對濕度70%，光照強度2000Lx～3000Lx，光照時間16h/d。6組培苗的快速擴繁6.1擴繁前采用酶聯(lián)免疫吸附試驗法檢測基礎苗是否帶病毒（PVX、PVY、PVS、PLRV、PVA、PVM），往復雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測基礎苗是否帶馬鈴薯紡錘塊莖類病毒（PSTVd）。6.2檢測合格的基礎苗在超凈工作臺上切斷擴繁。將培養(yǎng)容器置于超凈工作臺上，瓶口用75%乙醇擦拭消毒，用滅菌的長鑷子取出基礎苗，按單莖節(jié)切段，每個切段至少帶一個葉片，腋芽朝上插入MS培養(yǎng)基，用酒精燈烘烤瓶口，用封口膜封好，注明編號、品種名稱、接種時間。6.3培養(yǎng)條件為：白天23℃~25℃,夜間16℃~20℃,光照強度2000Lx～3000Lx，光照時間14h/d～16h/d，培