細(xì)菌感染的實驗診療培訓(xùn)課件

細(xì)菌感染的實驗診療感染的診斷有賴于從標(biāo)本中檢出病原體或檢出病原體的可溶性抗原,或病原體的DNA病人血清中檢出病原體的抗體本章主要討論檢出病原體的問題2細(xì)菌感染的實驗診療第一節(jié)實驗診斷的目的與要求3細(xì)菌感染的實驗診療進(jìn)行病原學(xué)診斷進(jìn)行藥敏試驗,指導(dǎo)合理用藥用作流行病學(xué)調(diào)查,追蹤傳染源研究病原生物與感染的關(guān)系一.目的4細(xì)菌感染的實驗診療

鮑氏痢疾志賀菌13型暴發(fā)

時間：1992年9月發(fā)?。?6名死亡：10名地點：某嬰兒室傳染源：慢性攜帶者產(chǎn)婦傳播方式：通過污染操作臺接觸5細(xì)菌感染的實驗診療鼠傷寒暴發(fā)

時間：1991年11月地點：某嬰兒室發(fā)病：55名死亡：23名56件物品（被褥，尿布，奶瓶）中26件檢出鼠傷寒沙門菌6細(xì)菌感染的實驗診療二.診斷試驗的選擇有價值的快速簡便的特異性和敏感性高的7細(xì)菌感染的實驗診療可用的方法:查病原體:直接涂片分離,對純培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定查可溶性抗原:用已知抗體查DNA:分子生物學(xué)方法查抗體:用已知抗原IgMIgG:效價有4倍以上增高8細(xì)菌感染的實驗診療三.細(xì)菌鑒定流程

雙歧檢索:以某一試驗分表解:用多種試驗整體分析數(shù)字編碼:將多種試驗分別編碼,數(shù)字化后查表9細(xì)菌感染的實驗診療革蘭氏陰性桿菌葡萄糖發(fā)酵+-氧化酶+-弧菌腸桿菌非發(fā)酵菌10細(xì)菌感染的實驗診療ABCDE甲乙丙丁++--++++----++--+-++11細(xì)菌感染的實驗診療組別試驗代碼結(jié)果結(jié)果代碼總值1A4-01B2-0C1+1

2D4+45E2-0F1+1

15…12細(xì)菌感染的實驗診療微量生化反應(yīng)系統(tǒng)和自動化

各試驗孔含不同試驗的脫水底物

加入純化的被檢菌

孵育4-24h觀察結(jié)果人工讀取根據(jù)編碼資料判定菌種或電腦讀取13細(xì)菌感染的實驗診療第二節(jié)臨床標(biāo)本的采集與處理14細(xì)菌感染的實驗診療一.標(biāo)本采集的原則早期,用抗菌藥物前根據(jù)病原體存在的部位采集相應(yīng)標(biāo)本無菌技術(shù),避免正常菌群污染,防止病原體播散采用合適的方法15細(xì)菌感染的實驗診療二.標(biāo)本的處理盡快接種到合適的培養(yǎng)基上根據(jù)抵抗力選擇保存和運輸條件厭氧菌奈瑟菌病毒16細(xì)菌感染的實驗診療第三節(jié)細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查17細(xì)菌感染的實驗診療一.不染色標(biāo)本用懸滴法或壓片細(xì)菌是活的,可觀察運動加入特異抗體可抑制其運動結(jié)合標(biāo)本來源可作初步診斷,如霍亂,梅毒用相差或暗視野顯微鏡效果更好18細(xì)菌感染的實驗診療壓片懸滴法19細(xì)菌感染的實驗診療二.染色標(biāo)本革蘭染色(Gramstain):紫色革蘭陽性;紅色革蘭陰性.注意細(xì)菌的大小,形狀,排列以及著色的均一性抗酸染色(acid-faststain):紅色抗酸陽性,藍(lán)色抗酸陰性熒光染色:更易觀察20細(xì)菌感染的實驗診療特殊染色可用于觀察莢膜,鞭毛等細(xì)菌的特殊結(jié)構(gòu)21細(xì)菌感染的實驗診療第四節(jié)細(xì)菌的分離培養(yǎng)22細(xì)菌感染的實驗診療一.細(xì)菌生長的要求培養(yǎng)基:營養(yǎng)物質(zhì),pH7.4氣體:需氧菌,厭氧菌,兼性厭氧菌,微需氧菌溫度:一般37°C時間:一般18~24h23細(xì)菌感染的實驗診療二.培養(yǎng)基1.對培養(yǎng)基的基本要求足夠的營養(yǎng)物質(zhì)合適的pH無菌澄清24細(xì)菌感染的實驗診療2.培養(yǎng)基的種類按培養(yǎng)基成分分:基礎(chǔ)培養(yǎng)基:滿足一般細(xì)菌要求營養(yǎng)培養(yǎng)基:滿足苛求細(xì)菌要求鑒別培養(yǎng)基:加有被利用物和指示劑選擇培養(yǎng)基:加有抑制劑,能抑制非目的菌生長特殊培養(yǎng)基:滿足特殊細(xì)菌要求25細(xì)菌感染的實驗診療按培養(yǎng)基物理性狀分:液體:增菌固體:加2%瓊脂,平板用于分離純種,斜面用于傳代或保存細(xì)菌半固體:加0.5%瓊脂,用于觀察動力,保存菌種26細(xì)菌感染的實驗診療三.主要的接種方法分區(qū)劃線法:用于分離純種,多次燒灼減少菌數(shù),以獲取單個菌落連續(xù)劃線:不要求單個菌落,用于保存或繁殖細(xì)菌涂布:使細(xì)菌長成菌苔,可觀察細(xì)菌被抑制情況或用于繁殖細(xì)菌傾注平板:少量細(xì)菌混于瓊脂中倒板,計數(shù),分離純種27細(xì)菌感染的實驗診療四.細(xì)菌生長的表現(xiàn)固體基:菌落形成,注意其

大小,形狀表面,邊緣質(zhì)地,透明度溶血情況液體基:渾濁,菌膜,沉淀28細(xì)菌感染的實驗診療五.純種的獲得純種是細(xì)菌學(xué)工作的基礎(chǔ)獲得方法:劃線分離法(傾注平板法)獲得大的單個菌落斜面純培養(yǎng)物純培養(yǎng)物的外觀表現(xiàn)應(yīng)是一致的29細(xì)菌感染的實驗診療30細(xì)菌感染的實驗診療31細(xì)菌感染的實驗診療六.培養(yǎng)細(xì)菌的目的確定有無細(xì)菌鑒定細(xì)菌藥敏試驗計數(shù)細(xì)菌利用細(xì)菌:制備菌苗,生產(chǎn)抗生素或基因工程產(chǎn)品32細(xì)菌感染的實驗診療第五節(jié)細(xì)菌代謝產(chǎn)物的檢測33細(xì)菌感染的實驗診療一.細(xì)菌毒素的檢測內(nèi)毒素:致熱作用:兔體溫鱟試驗外毒素:體內(nèi):毒素與抗毒素的中和試驗體外:Elek平板法:沉淀反應(yīng)ELISA34細(xì)菌感染的實驗診療毒素和抗毒素的中和試驗外毒素?外毒素?+已知抗體小白鼠小白鼠結(jié)果發(fā)病發(fā)病有毒性,但不是相應(yīng)的發(fā)病不發(fā)病是相應(yīng)毒素不發(fā)病不發(fā)病無毒性35細(xì)菌感染的實驗診療抗毒素待測細(xì)菌沉淀線Elek試驗36細(xì)菌感染的實驗診療二.生化反應(yīng)欲檢測細(xì)菌的生化反應(yīng),一般是在合適的培養(yǎng)基中加入被測物和檢測其代謝產(chǎn)物的試劑,即在鑒別培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),或直接加試劑于培養(yǎng)物中,觀察呈色等現(xiàn)象判定結(jié)果

37細(xì)菌感染的實驗診療(一)碳水化合物的代謝試驗糖(醇)發(fā)酵試驗:酸,氣體氧化-發(fā)酵(O/F)試驗:?-半乳糖苷酶(ONPG)試驗七葉苷水解試驗甲基紅試驗V-P試驗38細(xì)菌感染的實驗診療(二)蛋白質(zhì)和氨基酸的代謝試驗

明膠液化試驗Indol試驗Ura試驗H2S試驗苯丙氨酸脫氨酶試驗氨基酸脫羧酶試驗39細(xì)菌感染的實驗診療(三)碳源氮源利用枸櫞酸鹽利用試驗丙二酸鹽利用試驗40細(xì)菌感染的實驗診療枸櫞酸鹽利用試驗41細(xì)菌感染的實驗診療(四)酶氧化酶試驗過氧化氫酶試驗硝酸鹽還原試驗卵磷脂酶試驗?zāi)堂冈囼濩AMP試驗?zāi)懼芫囼?2細(xì)菌感染的實驗診療(五)抑菌試驗O/129試驗桿菌肽試驗Optochin試驗43細(xì)菌感染的實驗診療一.血清學(xué)鑒定了解微生物的抗原結(jié)構(gòu)用已知抗體檢測細(xì)菌的抗原組合特異性較高多在鑒定的最后進(jìn)行可用多種血清學(xué)方法,細(xì)菌多用凝集反應(yīng),病毒多用中和試驗45細(xì)菌感染的實驗診療二.血清學(xué)診斷查抗體:用已知抗原IgM:感染的指標(biāo)IgG:效價有4倍以上增高或高于當(dāng)?shù)厝巳核蕉嘤糜诓〕梯^長的全身性感染46細(xì)菌感染的實驗診療第七節(jié)感染的分子生物學(xué)檢測檢出病原體DNA證明病原體存在47細(xì)菌感染的實驗診療一.核酸檢測的用途細(xì)菌分類臨床診斷,快速鑒定耐藥性檢測毒素檢測流行病學(xué)調(diào)查48細(xì)菌感染的實驗診療二.核酸檢測的方法

G+Cmol%PCR限制性內(nèi)切酶片段長度核酸雜交49細(xì)菌感染的實驗診療限制性內(nèi)切酶酶切分析

限制性內(nèi)切酶是能夠在一定部位切開DNA的酶同樣的內(nèi)切酶可將相同的DNA切成同樣數(shù)目的，同樣大小分子量的片段電泳后對所得圖譜進(jìn)行分析可判斷DNA是否相同50細(xì)菌感染的實驗診療1989年國外某醫(yī)院泌尿科3周內(nèi)從病人血，尿中分出8株不動桿菌，具有相同的耐藥性，經(jīng)SmalI酶切后出現(xiàn)相同片段，但與環(huán)境中或其他科室分出的不動桿菌不同，表明泌尿科的病人是由同一克隆引起的爆發(fā)51細(xì)菌感染的實驗診療某醫(yī)院ICU病房，從水池和病人標(biāo)本中分出多株銅綠假單胞菌，將其染色體DNA用XBal酶切，發(fā)現(xiàn)彼此之間沒有共同的酶切片段圖譜，病人之間圖譜的也不相同，說明這不是一次爆發(fā)52細(xì)菌感染的實驗診療第八節(jié)動物實驗53細(xì)菌感染的實驗診療一.動物實驗的用途分離細(xì)菌,獲取純種檢測其致病性,觀察發(fā)病或死亡,可同時加抗體進(jìn)行中和試驗或保護(hù)試驗制備抗體誘導(dǎo)變異建立感染模型檢測生物制品的安全性

54細(xì)菌感染的實驗診療二.實驗動物的選擇多用易感的小動物,如小白鼠,豚鼠按需要選擇純系,突變系,雜種無菌動物(GF),悉生動物(GB),無特殊病原體動物(SPF),最低限度疾病動物(MDA),普通動物可選用多種途徑注射,如腹腔,靜脈,皮下,顱內(nèi)等55細(xì)菌感染的實驗診療可供細(xì)菌鑒定的方法形態(tài):個體,菌落,液體基生長情況生長需要:氧,溫度,營養(yǎng)物生化反應(yīng):觀察其酶活性抗原性:用已