光反應(yīng)性活性氧（ROS）測(cè)定試驗(yàn)方法

———附件5光反應(yīng)性活性氧（ROS）測(cè)定試驗(yàn)方法ReactiveOxygenSpecies(ROS)AssayforPhotoreactivity1范圍本方法規(guī)定了化妝品用化學(xué)原料光反應(yīng)性活性氧（ROS）測(cè)定試驗(yàn)的基本要求和方法。本方法適用于預(yù)測(cè)化妝品用化學(xué)原料的潛在光毒性。2試驗(yàn)?zāi)康念A(yù)測(cè)化妝品用化學(xué)原料是否具有潛在光毒性。3定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本方法。3.1光反應(yīng)性Photoreactivity化學(xué)物質(zhì)由于吸收光子而與另一個(gè)分子發(fā)生反應(yīng)的性質(zhì)。3.2光毒性Phototoxicity皮膚一次接觸化學(xué)物質(zhì)后，繼而暴露于紫外線照射下所引發(fā)的一種皮膚毒性反應(yīng)，或者全身應(yīng)用化學(xué)物質(zhì)后，暴露于紫外線照射下發(fā)生的類似反應(yīng)。本方法所述光毒性包括光刺激性、光過(guò)敏性和光遺傳毒性。3.3輻照度Irradiance照射到某一表面的紫外線或可見(jiàn)光的強(qiáng)度，單位為瓦每平方米（W/m2）或毫瓦每平方厘米（mW/cm2）。3.4光照劑量Doseoflight照射到某一表面的紫外線或可見(jiàn)光的量[=強(qiáng)度×?xí)r間（秒）]，單位為焦耳每平方米（J/m2）或焦耳每平方厘米（J/cm2）。3.5活性氧種類ReactiveOxygenSpecies，ROS活性氧種類，包括單線態(tài)氧和超氧陰離子。3.6單線態(tài)氧SingletOxygen，SO由光輻照化學(xué)物質(zhì)通過(guò)Ⅱ型光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的一種自由基。3.7超氧陰離子SuperoxideAnion，SA由光輻照化學(xué)物質(zhì)通過(guò)I型光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的一種自由基。4試驗(yàn)原理一些具有光反應(yīng)性的化學(xué)物質(zhì)暴露于紫外線時(shí)，吸收某一波長(zhǎng)光子，誘導(dǎo)發(fā)色團(tuán)激發(fā)，激發(fā)能量轉(zhuǎn)移到氧分子上，發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生活性氧（包括單線態(tài)氧SO和超氧陰離子SA），活性氧是光毒性反應(yīng)中的重要中間物質(zhì)。單線態(tài)氧和咪唑反應(yīng)生成的過(guò)氧化物中間體對(duì)N,N-二甲基-4-亞硝基苯胺（RNO）具有漂白作用，使其在440nm下的吸光度降低。超氧陰離子與氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）反應(yīng)生成NBT+，其在560nm波長(zhǎng)下具有光吸收。本試驗(yàn)方法通過(guò)分光光度法測(cè)定化學(xué)物質(zhì)經(jīng)紫外線照射后對(duì)RNO在440nm下吸光度的減少及對(duì)NBT+在560nm下吸光度的增加來(lái)判斷該化學(xué)物質(zhì)是否具有光反應(yīng)性。5試劑和材料除另有規(guī)定外，本方法所用試劑均為分析純或以上規(guī)格，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。所有試劑應(yīng)在配制后1個(gè)月內(nèi)使用，并且在使用前應(yīng)超聲處理，以免物質(zhì)析出、沉淀對(duì)試驗(yàn)造成影響。主要試劑配制方法如下：5.1磷酸二氫鈉。5.2磷酸氫二鈉。5.3N,N-二甲基-4-亞硝基苯胺（RNO）。5.4咪唑。5.5氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）。5.6pH7.4的20mmol/L磷酸鈉緩沖液（NaPB）稱取593mgNaH2PO4·2H2O（CAS：13472-35-0）和5.8gNa2HPO4·12H2O（CAS:10039-32-4），加入約900mL水，混勻，用1mol/L的HCl將pH值調(diào)節(jié)為7.4，定容至1000mL后混勻。于2℃~8℃冰箱或室溫保存。5.70.2mmol/LN,N-二甲基-4-亞硝基苯胺（RNO，CAS：138-89-6）稱取3mgRNO，溶于100mL20mmol/L的磷酸鈉緩沖液中，充分混勻。于2℃~8℃冰箱避光保存。5.80.2mmol/L咪唑（CAS：288-32-4）稱取13.6mg咪唑，溶于10mL20mmol/L的磷酸鈉緩沖液中，充分混勻，得到20mmol/L咪唑溶液。用20mmol/L的磷酸鈉緩沖液將20mmol/L咪唑溶液稀釋100倍，充分混勻。于2℃~8℃冰箱避光保存。5.90.4mmol/L氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT，CAS：298-83-9）稱取32.7mgNBT，溶于100mL20mmol/L的磷酸鈉緩沖液中，充分混勻。于2℃~8℃冰箱避光保存。5.10溶劑的選擇優(yōu)先使用分析級(jí)二甲基亞砜（DMSO）。對(duì)于不溶于DMSO的受試物，可使用20mmol/L的磷酸鈉緩沖液作為溶劑。如果受試物在DMSO和磷酸鈉緩沖液中不溶或不穩(wěn)定，也可使用其他溶劑，但應(yīng)保證受試物在所選溶劑中穩(wěn)定，且參考化學(xué)物質(zhì)的SO值和SA值應(yīng)在附錄A規(guī)定的范圍內(nèi)。5.11待測(cè)化學(xué)物質(zhì)溶液的配制待測(cè)化學(xué)物質(zhì)的分子量應(yīng)是已知的。測(cè)試終濃度為200μmol/L，如果在200μmol/L濃度下的反應(yīng)混合物有沉淀、著色或其他干擾等現(xiàn)象，則可以使用20μmol/L為終濃度進(jìn)行測(cè)試。當(dāng)待測(cè)化學(xué)物質(zhì)在20μmol/L的終濃度下得到陽(yáng)性結(jié)果，表示該物質(zhì)具有光反應(yīng)性；但在濃度低于20μmol/L下得到陰性結(jié)果，不能表示該物質(zhì)無(wú)光反應(yīng)性。待測(cè)化學(xué)物質(zhì)溶液應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配，所有操作均應(yīng)避免在強(qiáng)紫外線和強(qiáng)可見(jiàn)光照射（例如頭頂燈下或在自然光暴露的窗戶附近工作），以避免在試驗(yàn)前待測(cè)化學(xué)物質(zhì)發(fā)生光激活或光降解。待測(cè)化學(xué)物質(zhì)在試管中稱重，加入5.10項(xiàng)溶劑，渦旋混勻，超聲5-10min，配制成10mmol/L（終濃度200μmol/L）。當(dāng)終濃度200μmol/L的反應(yīng)混合物在光照前觀察到沉淀、著色或其他干擾等現(xiàn)象時(shí)，需將10mmol/L的溶液用DMSO稀釋成1mmol/L溶液（終濃度20μmol/L）。對(duì)于不溶于DMSO的化學(xué)物質(zhì)，使用其他溶劑（如磷酸鈉緩沖溶液）時(shí)，須使得反應(yīng)混合物中含有20μLDMSO（2%，v/v）。5.12陰性對(duì)照及陽(yáng)性對(duì)照以奎寧鹽酸鹽二水合物（CAS：6119-47-7）作為陽(yáng)性對(duì)照，以二苯甲酮-4（CAS：4065-45-6）作為陰性對(duì)照。用DMSO按與受試物相同的方法將陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照配制成10mmol/L的儲(chǔ)備溶液，分裝后于-20℃冰箱凍存，于使用當(dāng)天解凍，避免反復(fù)凍融，1個(gè)月內(nèi)使用完畢。6儀器和設(shè)備6.1太陽(yáng)光模擬器6.1.1選擇合適的光源用于提供紫外線和可見(jiàn)光的照射，通過(guò)濾光片減少波長(zhǎng)小于290nm的UVC，使光源盡量接近室外日光。推薦的測(cè)試條件如下：配備濾光片的太陽(yáng)模擬器（減少紫外線波長(zhǎng)<290nm）（見(jiàn)附錄B）—輻照度：1.8mW/cm2至2.2mW/cm2，照射1小時(shí)（例如，AtlasSuntestCPS+的指標(biāo)設(shè)置值為250W/m2），—UVA光照劑量：6.5J/cm2至7.9J/cm2（見(jiàn)附錄B）。配備濾光片的太陽(yáng)模擬器（減少紫外線波長(zhǎng)<300nm）（見(jiàn)附錄B）—輻照度：3.0mW/cm2至5.0mW/cm2，照射1小時(shí)（例如，SericSXL-2500V2），—UVA光照劑量：11J/cm2至18J/cm2（見(jiàn)附錄B）。6.1.2測(cè)試條件根據(jù)實(shí)際選擇合適具體條件。6.1.3ROS的產(chǎn)生受溫度影響，太陽(yáng)光模擬器應(yīng)配備溫度控制裝置，光照期間溫度在20℃~29℃。6.2反應(yīng)容器推薦使用石英反應(yīng)容器（規(guī)格見(jiàn)附錄C），避免液體蒸發(fā)以及由于塑料蓋造成的UV損失。也可使用其他UV透射率大于95%的蓋子或密封件替代。實(shí)驗(yàn)室使用其他容器時(shí)，應(yīng)使用附錄A中的參考化學(xué)物質(zhì)（序號(hào)1-17號(hào)）確定合適的儀器輻照度及光劑量。6.3酶標(biāo)儀。6.4UVA紫外照度計(jì)。6.5顯微鏡。7分析步驟7.1將下列成分在避光條件下混合：7.1.1溶劑為DMSO的受試物：?jiǎn)尉€態(tài)氧SO超氧陰離子SA20mmol/LNaPB480μL0.2mmol/L咪唑250μL0.2mmol/LRNO250μL10或1mmol/L受試物20μL20mmol/LNaPB855μL0.4mmol/LNBT125μL10或1mmol/L受試物20μL7.1.2溶劑為NaPB的受試物：?jiǎn)尉€態(tài)氧SO超氧陰離子SA20mmol/LNaPB460μL0.2mmol/L咪唑250μL0.2mmol/LRNO250μLDMSO20μL10或1mmol/L受試物20μL20mmol/LNaPB835μL0.4mmol/LNBT125μLDMSO20μL10或1mmol/L受試物20μL以20μL溶劑替代受試物，作為空白對(duì)照。渦旋或超聲5~10min后，將200μL反應(yīng)混合物加入到96孔板中，每組設(shè)置3個(gè)平行。96孔板加樣詳見(jiàn)附錄D。7.2在100倍顯微鏡下檢查反應(yīng)混合物中各組分溶解情況。如有沉淀、析出等現(xiàn)象，需降低受試物濃度重新檢測(cè)或停止檢測(cè)。將96孔板震蕩5s后，使用分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀測(cè)定光照前SO檢測(cè)孔在440nm下的吸光度及SA檢測(cè)孔在560nm下的吸光度。7.3將96孔板置于石英反應(yīng)器中，或蓋上其他具有高UV透射率的蓋子或密封件，置于太陽(yáng)光模擬器中照射1h。記錄光照前后的溫度。7.4完成光照后，將96孔板震蕩1min，使用分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀測(cè)定光照后SO檢測(cè)孔在440nm下的吸光度及SA檢測(cè)孔在560nm下的吸光度。步驟流程圖見(jiàn)附錄E8分析結(jié)果表述8.1SO值和SA值的計(jì)算計(jì)算受試物及對(duì)照品的SO值和SA值，根據(jù)三個(gè)平行孔的數(shù)據(jù)計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。1．根據(jù)光照前后SO測(cè)試孔在440nm下的吸光度計(jì)算受試物的SO值SO式中：A440(-)：光照前440nm下的吸光度A440(+)：光照后440nm下的吸光度a：光照前空白對(duì)照440nm下的吸光度（平均值）b：光照后空白對(duì)照440nm下的吸光度（平均值）2．根據(jù)光照前后SA測(cè)試孔在560nm下的吸光度計(jì)算受試物的SA值SA式中：A560(-)：光照前560nm下的吸光度A560(+)：光照后560nm下的吸光度a：光照前空白對(duì)照560nm下的吸光度（平均值）b：光照后空白對(duì)照560nm下的吸光度（平均值）8.2試驗(yàn)接受標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)應(yīng)滿足以下標(biāo)準(zhǔn)：1．光照前，反應(yīng)混合物中沒(méi)有受試物沉淀。2．光照前后，受試物對(duì)反應(yīng)混合物沒(méi)有顏色干擾。3．試驗(yàn)過(guò)程中溫度控制在20℃~29℃范圍內(nèi)。4．所有測(cè)試孔A440及A560應(yīng)在0.02~1.5范圍內(nèi)。5．應(yīng)根據(jù)歷史數(shù)據(jù)平均值±2標(biāo)準(zhǔn)偏差建立實(shí)驗(yàn)室內(nèi)陰性對(duì)照與陽(yáng)性對(duì)照的質(zhì)控范圍。以下為根據(jù)驗(yàn)證數(shù)據(jù)得出的95%置信區(qū)間：200μmol/L奎寧鹽酸鹽二水合物200μmol/L二苯甲酮-4SO：319至583SA：193至385SO：-9至11SA：-20至28.3受試物的光反應(yīng)性評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)評(píng)判受試物的光反應(yīng)性：分類樣品濃度SOSA具有光反應(yīng)性200μmol/L≥25和≥70<25和/或有干擾和≥70≥25和<70和/或有干擾具有弱光反應(yīng)性200μmol/L<25和≥20，<70具有光反應(yīng)性20μmol/L≥25和≥20無(wú)光反應(yīng)性200μmol/L<25和<20不確定不屬于上述任何一種情況如受試物在200μmol/L和20μmol/L濃度下均有沉淀、著色或其他干擾，則認(rèn)為該受試物不適用于本方法，受試物的光反應(yīng)性不確定。9其他限制說(shuō)明在活性氧（ROS）檢測(cè)過(guò)程中，會(huì)發(fā)生如下兩個(gè)反應(yīng)：?jiǎn)尉€態(tài)氧和咪唑反應(yīng)生成的過(guò)氧化物中間體對(duì)N,N-二甲基-4-亞硝基苯胺（RNO）具有漂白作用；超氧陰離子與氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）反應(yīng)生成NBT+。該方法不適用于對(duì)上述兩個(gè)反應(yīng)產(chǎn)生干擾的化學(xué)品測(cè)試，例如，抗壞血酸和其他還原性化學(xué)品，它們會(huì)將四唑鹽直接還原為甲瓚，抗壞血酸還加速咪唑衍生物的氧化，在ROS測(cè)定中提供假陽(yáng)性預(yù)測(cè)。

附錄A參考化學(xué)物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果可接受范圍表117種參考化學(xué)物質(zhì)SO值和SA值測(cè)定數(shù)據(jù)的可接受范圍。編號(hào)化學(xué)物名稱CAS編號(hào)SOSA溶劑濃度1對(duì)氨基苯甲酸150-13-0-8~12-11~7DMSO200μmol/L2對(duì)氨基苯甲酸乙酯94-09-7-7~9-7~17DMSO200μmol/L3鹽酸多西環(huán)素10592-13-9115~429230~468DMSO200μmol/L4紅霉素114-07-8-15~11-9~21DMSO200μmol/L5非諾貝特49562-28-977~203-31~11DMSO20μmol/L6L-組氨酸71-00-1-8~128~120NaPB200μmol/L7諾氟沙星70458-96-7131~27157~161DMSO200μmol/L88-甲氧基補(bǔ)骨脂素298-81-731~1370~126DMSO200μmol/L9水楊酸異辛酯118-60-5-5~11-8~20DMSO20μmol/L10吖啶260-94-6182~328121~243DMSO200μmol/L11鹽酸氯丙嗪69-09-0-56~7066~106DMSO200μmol/L12雙氯芬酸鈉15307-79-634~41647~437DMSO200μmol/L13呋噻米54-31-931~225-7~109DMSO200μmol/L14酮基布洛芬22071-15-4120~34677~151DMSO200μ