第五講基因定點誘變技術(shù)

第五講基因定點誘變技術(shù)第1頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月M.Smith（加拿大生物化學(xué)家）1993年諾貝爾化學(xué)獎，1978年發(fā)明了寡核苷酸定點誘變技術(shù)。利用寡核苷酸定點誘變技術(shù)，可以認(rèn)為地通過基因的改變來修飾、改造某一已知的蛋白質(zhì)，從而可以研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及其與功能的關(guān)系、蛋白質(zhì)之間的相互作用。寡核苷酸定點誘變技術(shù)第2頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月基因誘變的應(yīng)用1結(jié)構(gòu)和功能2基因的注釋3代謝途徑-分子育種4蛋白質(zhì)的修飾5分子設(shè)計-分子進(jìn)化工程第3頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月缺失誘變1簡單缺失通過對DNA片段中具有的相應(yīng)的酶切位點進(jìn)行切割，而后用T4連接酶進(jìn)行連接。2系統(tǒng)缺失核酸外切酶III、S1核酸酶、Klenow大片段第4頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月插入突變1人工合成片段2Transposoninsertion（Tn5）3同源重組4PCR第5頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月基因的體外誘變第6頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月Kunkel法或稱”U”法

dut-：dUTP酶（dUTPase）缺陷，細(xì)胞不能把dUTP轉(zhuǎn)化為dUMP,因此細(xì)胞內(nèi)dUTP的含量大為增加，其中一些dUTP可摻入DNA中正常情況下有“T”占據(jù)的位置。

ung-：UDG酶缺陷，UDG酶（尿嘧啶-N-糖基化酶）可除去DNA中的尿嘧啶第7頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月E.Coli（dut-，ung-）合成的DNA中含有尿嘧啶，M13噬菌體DNA中將含有20-30個尿嘧啶堿基。CJ236(dut-，ung-，F(xiàn)+

)第8頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月ssDNA制備載體1單鏈?zhǔn)删w載體M132phagemid載體-輔助噬菌體第9頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月所用酶類T4噬菌體聚合酶：誘變幾率65%T7噬菌體聚合酶：3‘-5’外切活性強(qiáng)，持續(xù)合成DNA的能力強(qiáng)，遇到引物時會停止。誘變幾率83%KlenowDNA聚合酶：前端有引物或雙鏈時，可能會替換。誘變幾率36%第10頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月影響因素1引物：熱動力學(xué)（配對），突變堿基的左右8-10bp2T4連接酶35’端磷酸化4單鏈結(jié)合蛋白：解決頸環(huán)結(jié)構(gòu)第11頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月基因擴(kuò)增（geneamplification）

主要內(nèi)容：1.體外擴(kuò)增2.通過體外重組和轉(zhuǎn)化，將目的基因在宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增3.在環(huán)境作用下，生物體內(nèi)相關(guān)基因的擴(kuò)增。4.程序基因擴(kuò)增5.進(jìn)化過程中的基因擴(kuò)增第12頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR技術(shù)在1983年，美國Cetus公司人類遺傳研究室的科學(xué)家K.B.Mullis發(fā)明的。PCR是一種在體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列的方法，有稱之為體外擴(kuò)增法。第13頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’靶DNA的擴(kuò)增(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互補鏈引物1互補鏈單位長度的鏈不同長度的鏈5’3’3’5’引物1互補鏈引物2互補鏈目的片段（不同長度的鏈未示出）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)示意圖(e)(f)(g)第14頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月溫度（℃）時間（min）94726094℃變性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循環(huán)1循環(huán)2循環(huán)3PCR反應(yīng)的溫度循環(huán)周期PCR反應(yīng)的每一個溫度循環(huán)周期都是由DNA變性、引物退火和反應(yīng)延伸三個步驟完成的。圖中設(shè)定的反應(yīng)參數(shù)是94℃變性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而復(fù)始，重復(fù)進(jìn)行，直至擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量滿足實驗需求為止。第15頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月ReactionConditionforaTypicalPCRAssay第16頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月TypicalPCRThermalProfile*ThiscycleisnormallyincludedinaPCRassayinordertoallowany“unfinished”productfrompreviousamplificationtoachieveitsfulllength第17頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月SomeDNAPolymerasesUsedinPCR第18頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月CharacteristicsofTaqPolymerase

第19頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR引物：與待擴(kuò)增的靶DNA區(qū)段兩端序列互補的人工合成的寡核苷酸片斷。1.其長度通常在15~30個核苷酸之間。2.簡并引物atggctant…3.嵌套引物PCR擴(kuò)增的長度：<2kb第20頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月PCR技術(shù)的應(yīng)用：1.基因組克隆突變體的鑒定和在PCR過程中有目的的添加核算序列。第21頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月第22頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月反相PCR(reversePCR)與染色體步移第23頁，課件共24頁，創(chuàng)作于2023年2月不對稱PCR(asymmertricPCR)用來制備單