(3.2)-第2章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法

第二章細(xì)胞生物學(xué)研究方法第一節(jié)、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法第二節(jié)、細(xì)胞組分的分析方法第三節(jié)、細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程第四節(jié)、細(xì)胞及生物大分子的動(dòng)態(tài)變化第五節(jié)、模式生物與功能基因組的研究第一節(jié)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的觀察方法

一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy）二、電子顯微鏡技術(shù)(Electromicroscopy)三、掃描遂道顯微鏡(scanningtunnelingmicroscope)一、光學(xué)顯微鏡技術(shù)（lightmicroscopy）1、普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)2、相差顯微鏡和微分干涉顯微鏡3、熒光顯微鏡技術(shù)4、激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)5、暗視野顯微鏡（一）普通復(fù)式光學(xué)顯微鏡技術(shù)

分辨率是指區(qū)分開兩個(gè)質(zhì)點(diǎn)間的最小距離最大分辨率：0.2μm光學(xué)顯微鏡可以直接用于觀察單細(xì)胞生物或體外培養(yǎng)細(xì)胞蘇木精：核酸伊紅：細(xì)胞質(zhì)蘇丹：脂肪相差顯微鏡和微分干涉顯微鏡相差顯微鏡,將光程差或相位差轉(zhuǎn)換成振幅差。用途：適用于觀察活細(xì)胞和活組織，是體外細(xì)胞和組織培養(yǎng)不可或缺的工具。相差顯微鏡和微分干涉顯微鏡微分干涉顯微鏡:

以平面偏振光為光源。偏振光經(jīng)合成后，使樣品中厚度上的微小區(qū)別轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別，增加了樣品反差且具有立體感。適于研究活細(xì)胞中較大的細(xì)胞器。利用不同的顯微鏡所觀察到的神經(jīng)細(xì)胞暗視野顯微鏡相差顯微鏡微分干涉顯微鏡熒光：細(xì)胞中的某些物質(zhì)在紫外線照射下能夠發(fā)出可見光，稱為熒光。可分為自發(fā)熒光和誘發(fā)熒光。用途：在光鏡水平上，對(duì)細(xì)胞內(nèi)特異的蛋白質(zhì)、核酸、糖類、脂質(zhì)以及某些離子等組分進(jìn)行定位研究的有力工具。有兩個(gè)特殊的濾光片：激發(fā)濾光片、阻斷濾光片。A.熒光顯微鏡的工作原理與光路示意圖。B.不同熒光素所需激發(fā)光波長(zhǎng)與所產(chǎn)生的熒光波長(zhǎng)的比較。C.熒光顯微鏡顯示出在有絲分裂中期細(xì)胞中，紡錘體微管（綠色）、中期染色體（藍(lán)色）和原纖維狀蛋白（紅色）等結(jié)構(gòu)成分熒光顯微鏡技術(shù)網(wǎng)絡(luò)視頻/video/BV1st4y1e72X?spm_id_from=333.337.search-card.all.click溫馨提示：此視頻框在點(diǎn)擊“上傳手機(jī)課件”時(shí)會(huì)進(jìn)行轉(zhuǎn)換，用手機(jī)進(jìn)行觀看時(shí)則會(huì)變?yōu)榭牲c(diǎn)擊的視頻。此視頻框可被拖動(dòng)移位和修改大小GFP—綠色熒光蛋白激光共焦掃描顯微鏡技術(shù)用途：排除焦平面以外光的干擾，增強(qiáng)圖像反差和提高分辨率，可重構(gòu)樣品的三維結(jié)構(gòu)?？捎糜谘芯縼喖?xì)胞結(jié)構(gòu)與組分的定位及動(dòng)態(tài)變化A.熒光顯微鏡。B.激光共焦掃描顯微鏡。圖中顯示小鼠腎小球的厚切片中，用不同的標(biāo)記方法和不同的熒光染料，分別顯示其凝集素（綠色）、微絲（紅色）和細(xì)胞核（藍(lán)色）的分布。Figure3-14.Comparisonofconventionalandconfocalfluorescencemicroscopy.Thesetwomicrographsareofthesameintactgastrula-stageDrosophilaembryothathasbeenstainedwithafluorescentprobeforactinfilaments.Theconventional,unprocessedimage(A)isblurredbythepresenceoffluorescentstructuresaboveandbelowtheplaneoffocus.Intheconfocalimage(B),thisout-of-focusinformationisremoved,whichresultsinacrispopticalsectionofthecellintheembryo.

光學(xué)顯微鏡最容易觀察到的細(xì)胞器或細(xì)胞結(jié)構(gòu)是()。[中科院2006年研]

線粒體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞核微管ABCD提交可為此題添加文本、圖片、公式等解析，且需將內(nèi)容全部放在本區(qū)域內(nèi)。光學(xué)顯微鏡下只能看到較大的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞核、葉綠體等，線粒體需要染色后可觀察到。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、微管等在電子顯微鏡下可觀察到。答案解析單選題1分二、電子顯微鏡1932年，Ruska生產(chǎn)出第一臺(tái)電子顯微鏡1935年，法國(guó)的卡諾爾提出掃描電鏡的設(shè)計(jì)思想和工作原理1942年，劍橋大學(xué)的馬倫首次制成世界上第一臺(tái)掃描電鏡主要電鏡制樣技術(shù)超薄切片技術(shù)

用于電鏡觀察的樣本制備過程負(fù)染色技術(shù)（Negativestaining）冷凍蝕刻技術(shù)（Freezeetching）主要用來觀察膜斷裂面的蛋白質(zhì)顆粒和膜表面結(jié)構(gòu)。石蠟切片:3-10um;超薄切片:40-50nm超微切片技術(shù)環(huán)氧樹脂染色劑：醋酸鈾，枸櫞酸鉛固定劑：鋨酸，戊二醛骨骼肌細(xì)胞放大4500倍。左圖切片厚度為1μm；右圖切片厚度為0.025μm。重金屬離子能在核蛋白體四周沉淀下來，形成一個(gè)黑暗的背景，在核蛋白體內(nèi)部不能沉積而形成一個(gè)清晰的亮區(qū)，利用深色背景襯托出樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)，是觀察病毒等顆粒性樣品的常用技術(shù)。上圖為煙草病毒的負(fù)染色下圖為肌動(dòng)蛋白纖維冷凍蝕刻技術(shù)冰凍斷裂蝕刻復(fù)型Freeze-fractureelectronmicrographofthethylakoidmembranesfromthechloroplastofaplantcell.Thesemembranes,whichcarryoutphotosynthesis,arestackedupinmultiplelayers.ThelargestparticlesseeninthemembranearethecompletephotosystemII-acomplexofmultipleproteins.

Freeze-FractureandFreeze-EtchElectronMicroscopy

葉綠體的類囊體膜冷凍蝕刻技術(shù)主要用于()。[南開大學(xué)2011年研]

電子顯微鏡光學(xué)顯微鏡原子力顯微鏡激光共聚焦顯微鏡ABCD提交可為此題添加文本、圖片、公式等解析，且需將內(nèi)容全部放在本區(qū)域內(nèi)。主要電鏡制樣技術(shù)包括：①超薄切片技術(shù)；②負(fù)染色技術(shù)；③冷凍蝕刻技術(shù)④電鏡三維重構(gòu)技術(shù)；⑤掃描電鏡技術(shù)等。答案解析單選題1分電鏡三維重構(gòu)技術(shù)電子顯微術(shù)、電子衍射與計(jì)算機(jī)圖象處理相結(jié)合而形成的具有重要應(yīng)用前景的一門新技術(shù)。電鏡三維重構(gòu)技術(shù)與X-射線晶體衍射技術(shù)及核磁共振分析技術(shù)相結(jié)合，是當(dāng)前結(jié)構(gòu)生物學(xué)主要研究生物大分子空間結(jié)構(gòu)及其相互關(guān)系的主要實(shí)驗(yàn)手段。

網(wǎng)絡(luò)視頻/video/av28730741/?p=2溫馨提示：此視頻框在點(diǎn)擊“上傳手機(jī)課件”時(shí)會(huì)進(jìn)行轉(zhuǎn)換，用手機(jī)進(jìn)行觀看時(shí)則會(huì)變?yōu)榭牲c(diǎn)擊的視頻。此視頻框可被拖動(dòng)移位和修改大小電鏡三維重構(gòu)技術(shù)

掃描電鏡的原理：電子“探針”掃描，激發(fā)樣品表面放出二次電子，探測(cè)器收集二次電子成象。

CO2臨界點(diǎn)干燥法，防止引起樣品變形的表面張力問題掃描電子顯微鏡上皮細(xì)胞基底層微絨毛電子顯微鏡下的蚊子

鼠成纖維細(xì)胞第二節(jié)細(xì)胞及其組分的分析方法一、用超離心技術(shù)分離細(xì)胞組分二、細(xì)胞成分的細(xì)胞化學(xué)顯示方法三、特異蛋白抗原的定位與定性四、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性五、定量細(xì)胞化學(xué)分析與細(xì)胞分選技術(shù)一、用超離心技術(shù)分離細(xì)胞組分

用途：分離細(xì)胞器與生物大分子及其復(fù)合物

差速離心：分離密度不同的細(xì)胞組分

密度梯度離心：精細(xì)組分或生物大分子的分離均漿

1,000timesgravityfor10minutes

20,000timesgravityfor20minutes80,000timesgravityfor1hour

150,000timesgravityfor3hours

速率區(qū)帶離心：是指當(dāng)不同的顆粒間存在沉降速度差時(shí)，在一定的離心力作用下，顆粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介質(zhì)的不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法。密度梯度離心：用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞分層、分離。二、特異蛋白抗原的定位與定性利用免疫學(xué)方法進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)定位的原理免疫熒光技術(shù)：快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限。免疫電鏡技術(shù)：應(yīng)用：通過對(duì)分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動(dòng)態(tài)；胞內(nèi)酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等。細(xì)胞外蛋白質(zhì)的分析蛋白電泳(SDS)

免疫印跡反應(yīng)(Western-Blot)網(wǎng)絡(luò)視頻/video/BV12r4y1J7HP?spm_id_from=333.337.search-card.all.click溫馨提示：此視頻框在點(diǎn)擊“上傳手機(jī)課件”時(shí)會(huì)進(jìn)行轉(zhuǎn)換，用手機(jī)進(jìn)行觀看時(shí)則會(huì)變?yōu)榭牲c(diǎn)擊的視頻。此視頻框可被拖動(dòng)移位和修改大小蛋白電泳網(wǎng)絡(luò)視頻/video/BV1s3411P72f?spm_id_from=333.337.search-card.all.click溫馨提示：此視頻框在點(diǎn)擊“上傳手機(jī)課件”時(shí)會(huì)進(jìn)行轉(zhuǎn)換，用手機(jī)進(jìn)行觀看時(shí)則會(huì)變?yōu)榭牲c(diǎn)擊的視頻。此視頻框可被拖動(dòng)移位和修改大小免疫印跡反應(yīng)

用核酸探針確立特殊核苷酸序列在染色體上或在特殊類型細(xì)胞中的位置的方法稱為原位雜交技術(shù)(insituhybridization)。把凝膠電泳分離開的DNA片段，通過擴(kuò)散或電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，做成一個(gè)凝膠的復(fù)制品，這個(gè)過程叫做印跡。利用標(biāo)記的DNA探針檢測(cè)某一特定的DNA序列的方法稱為Southernblot，檢測(cè)特定RNA序列的方法稱為Northernblot。

三、細(xì)胞內(nèi)特異核酸的定位與定性人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片

利用一些顯色劑與所檢測(cè)物質(zhì)中一些特殊基團(tuán)特異性結(jié)合的特征，通過顯色劑在細(xì)胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質(zhì)在細(xì)胞中的分布和含量。

四、細(xì)胞成分的分析與細(xì)胞分選技術(shù)DNA特異性的顯示方法多糖的顯示方法脂類物質(zhì)的顯示流式細(xì)胞術(shù)DNA特異性的顯示方法Feulgen反應(yīng)：

利用酸水解去除細(xì)胞中的RNA，僅保留DNA，并且除去DNA嘌呤脫氧核糖核酸的嘌呤，使脫氧核糖的醛基暴露，所暴露出的自由醛基與希夫試劑中的無色品紅反應(yīng)呈紫紅色。蠶豆根尖細(xì)胞Feulgen反應(yīng)細(xì)胞核（紫紅色）核仁（無色）多糖的顯示方法PAS（過碘酸希夫氏）反應(yīng)利用過碘酸的強(qiáng)氧化作用破壞糖分子的C—C鍵，使糖分子氧化產(chǎn)生雙醛基，自由的醛基與希夫試劑作用形成紫紅色產(chǎn)物。PAS反應(yīng)淀粉顆粒脂類物質(zhì)的顯示方法對(duì)脂類物質(zhì)的染色應(yīng)用的是物理的擴(kuò)散原理。蘇丹類染料是脂溶性染劑，它溶于酒精但更易溶于脂肪，所以當(dāng)含有脂肪的標(biāo)本與蘇丹染料接觸時(shí)，它會(huì)脫離酒精而溶于脂類結(jié)構(gòu)中從而深紅色。 流式細(xì)胞儀（FlowCytometry）

主要應(yīng)用：用于定量測(cè)定細(xì)胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量；測(cè)定細(xì)胞群體中不同時(shí)相細(xì)胞的數(shù)量；從細(xì)胞群體中分離某些特異染色的細(xì)胞；分離DNA含量不同的中期染色體。網(wǎng)絡(luò)視頻/video/BV17P41157fD?spm_id_from=333.337.search-card.all.click溫馨提示：此視頻框在點(diǎn)擊“上傳手機(jī)課件”時(shí)會(huì)進(jìn)行轉(zhuǎn)換，用手機(jī)進(jìn)行觀看時(shí)則會(huì)變?yōu)榭牲c(diǎn)擊的視頻。此視頻框可被拖動(dòng)移位和修改大小流式細(xì)胞儀(多選)以下哪些技術(shù)一般不用于分離活細(xì)胞？()[廈門大學(xué)2011年研]流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞電泳超速離心差速離心ABCD提交可為此題添加文本、圖片、公式等解析，且需將內(nèi)容全部放在本區(qū)域內(nèi)。C項(xiàng)，超速離心機(jī)用于分離或分析鑒定病毒顆粒、細(xì)胞器或大分子生物樣品等。D項(xiàng)，差速離心是利用不同的離心速率產(chǎn)生的不同離心力，將各種亞細(xì)胞組分和各種顆粒分離，適于分離沉降速率差別較大的亞顯微結(jié)構(gòu)顆粒。答案解析多選題1分第三節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞工程一、細(xì)胞培養(yǎng)

二、細(xì)胞工程

一、細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的意義動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)

原代培養(yǎng)細(xì)胞（primaryculturecell）傳代培養(yǎng)細(xì)胞（sub-culturecell）

細(xì)胞系（cellline）

細(xì)胞株（cellstrain）：有特殊遺傳標(biāo)記的細(xì)胞系植物細(xì)胞培養(yǎng)

類型：?jiǎn)伪扼w細(xì)胞培養(yǎng)（花藥培養(yǎng)）

原生質(zhì)體培養(yǎng)（體細(xì)胞培養(yǎng)）

細(xì)胞培養(yǎng)：將動(dòng)、植物細(xì)胞或組織從機(jī)體內(nèi)取出分散成單細(xì)胞懸液，給予必要的生長(zhǎng)條件，讓其在培養(yǎng)基上繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖的過程。細(xì)胞培養(yǎng)的意義可以在離體條件下觀察研究細(xì)胞生命活動(dòng)的規(guī)律；觀察細(xì)胞對(duì)于各種生物活性物質(zhì)的反應(yīng)；通過細(xì)胞培養(yǎng)可以獲得大量性狀相同的細(xì)胞，是一種良好的實(shí)驗(yàn)材料。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)所需的一般條件：適宜的培養(yǎng)皿，小牛血清成分，37℃，PH等。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本過程：取材分離細(xì)胞選擇相同類型的細(xì)胞貼壁培養(yǎng)傳代動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)原代培養(yǎng)：從機(jī)體取出后立即進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)的細(xì)胞在生長(zhǎng)一定時(shí)間以后，就會(huì)由于營(yíng)養(yǎng)成分的消耗、代謝產(chǎn)物的積累以及接觸抑制等因素而停止生長(zhǎng)，因此必需將細(xì)胞傳到新的培養(yǎng)瓶中去使其繼續(xù)生長(zhǎng)。細(xì)胞系：原代培養(yǎng)的細(xì)胞一般傳至10代左右就不易傳下去了，細(xì)胞生長(zhǎng)出現(xiàn)停滯，但有極少數(shù)細(xì)胞可能渡過危機(jī)而傳下去，這些細(xì)胞一般又可順利傳代40-50代，并且保持染色體的二倍體數(shù)量及接觸抑制的行為。這種傳代細(xì)胞稱為細(xì)胞系。永生細(xì)胞系（傳代細(xì)胞系）：由細(xì)胞株傳至50代后又出現(xiàn)危機(jī)不能再傳下去，但是如果有部分細(xì)胞發(fā)生了遺傳突變就有可能在體外培養(yǎng)的條件下無限制地傳下去。這些細(xì)胞具有癌細(xì)胞的特點(diǎn)，這種傳代細(xì)胞稱為細(xì)胞系。細(xì)胞系的特點(diǎn)是染色體發(fā)生明顯變化，失去接觸抑制的特性。實(shí)驗(yàn)室中常用的細(xì)胞系雖然龜?shù)淖罡邏勖?75歲，而小鼠的壽命只有幾年，但它們的細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)分裂的極限基本相同。()[浙江師范大學(xué)2010年研]

對(duì)錯(cuò)AB提交可為此題添加文本、圖片、公式等解析，且需將內(nèi)容全部放在本區(qū)域內(nèi)。任何動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)均需從原代細(xì)胞培養(yǎng)做起。原代培養(yǎng)的細(xì)胞一般傳10代左右就不易傳下去了，大部分細(xì)胞生長(zhǎng)停滯、衰老死亡，有極少數(shù)細(xì)胞可存活，并能順利地傳40-50代次，仍保持原來染色體的二倍體數(shù)量及接觸抑制的行為，一般情況下，傳至50代以后細(xì)胞就不能再傳下去了。答案解析單選題1分名稱類型來源3T3成纖維細(xì)胞小鼠Hela宮頸癌上皮細(xì)胞HenrittalLacksBHK21成纖維細(xì)胞敘利亞倉(cāng)鼠PtK1上皮細(xì)胞袋鼠L6成肌細(xì)胞大鼠PCI2嗜鉻細(xì)胞大鼠SP2漿細(xì)胞小鼠SP2/0骨髓瘤漿細(xì)胞小鼠CHO卵巢細(xì)胞中國(guó)倉(cāng)鼠實(shí)驗(yàn)室中幾種常用的細(xì)胞系

二、細(xì)胞工程

細(xì)胞工程是一種在細(xì)胞水平上運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的方法改變生物遺傳性狀的生物工程。細(xì)胞融合（cellfusion）技術(shù)單克隆抗體（monocloneantibody）技術(shù)顯微操作技術(shù)質(zhì)粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)其它技術(shù)遺傳分析（mutant,knockout,knockin）正向遺傳學(xué)；反向遺傳學(xué)顯微操作儀轉(zhuǎn)基因顯微操作過程

第四節(jié)細(xì)胞及生物大分子的動(dòng)態(tài)變化慕課視頻片段視頻名稱：[2.4]細(xì)胞及生物大分子的動(dòng)態(tài)變化.mp4溫馨提示：此視頻框在點(diǎn)擊“上傳手機(jī)課件”時(shí)會(huì)進(jìn)行轉(zhuǎn)換，用手機(jī)進(jìn)行觀看時(shí)則會(huì)變?yōu)榭牲c(diǎn)擊的視頻。此視頻框可被拖動(dòng)移位和修改大小1）其生理特征能夠代表生物界的某一大類群；4）容易進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，特別是遺傳學(xué)分析。2）容易獲得并易于在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)、繁殖；3）世代短、子代多、遺傳背景清楚；一種模式生物應(yīng)具備的特點(diǎn)第五節(jié)模式生物與功能基因組的研究最常見的模式生物病毒(virus)大腸桿菌(Escherichiacoli)酵母(yeast)秀麗線蟲(Caenorhabditiselegans)果蠅(Drosophilamelanogaster)斑馬魚(zebrafish)小鼠(mouse)擬南芥(Arabidopsis)水稻(Rice,OryzasativaL.)酵母的基因組于1996年測(cè)序完成，

其基因組含1.2×108個(gè)堿基對(duì)，約有6200個(gè)基因。

線蟲的基因組于1998年測(cè)序完成，是人類得到的第一個(gè)動(dòng)物物種的基因組，共有109個(gè)堿基對(duì)，約含18400個(gè)基因。果蠅的基因組于2000年測(cè)序完成，

共有1.2×105

kb堿基，約含13601個(gè)基因。

在20世紀(jì)生命科學(xué)發(fā)展的歷史長(zhǎng)河中，果蠅扮演了十分重要的角色，是十分活躍的模型生物。1摩爾根利用果蠅證實(shí)了孟德爾定律，而且發(fā)現(xiàn)了果蠅白眼突變的性連鎖遺傳，提出了基因在染色體上直線排列以及連鎖交換定律1933年因此被授予諾貝爾獎(jiǎng)。21946年，摩爾根的學(xué)生，被譽(yù)為“果蠅的突變大師”的米勒，證明Ｘ射線能使果蠅的突變率提高150倍，因而成為諾貝爾獎(jiǎng)獲得者。31995年，諾貝爾獎(jiǎng)再次授予三位在果蠅研究中劉易斯、尼爾森沃哈德和維斯郝斯。果蠅為進(jìn)一步闡明基因—神經(jīng)（腦）—行為之間關(guān)系的研究提供了理想的動(dòng)物模型斑馬魚透明斑馬魚熒光斑馬魚小鼠的基因組測(cè)序工作2002年完成，其基因組共有3.0×109個(gè)堿基對(duì)，約含30000個(gè)基因。

擬南芥的基因組于2000年測(cè)序完成，是人類搞清的第一個(gè)植物物種的基因組，共有1.25×109個(gè)堿基對(duì)，約有25000個(gè)基因。2002年12月宣布，利用克隆連克隆（逐步克?。y(cè)定法，完成了水稻12條染色體的堿基測(cè)序工作。估計(jì)水稻基因組中