出入境口岸霍亂弧菌多重聚合酶鏈反應(yīng)操作規(guī)程

中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)出入境口岸霍亂弧菌多重聚合酶鏈反應(yīng)操作規(guī)程ExaminationcodesofmultiplexPCRforVibriocholera2007-04-06發(fā)布中，華人民共，和國(guó)出入境口岸霍亂弧菌多重聚合酶鏈反應(yīng)操作規(guī)程6.2實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)6.2.1樣品采集、增菌培養(yǎng)和細(xì)菌分離鑒定按照GB15984和SN/T1239相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。6.2.2用于細(xì)菌DNA提取的樣本的前處理6.2.2.1霍亂弧菌菌株的處理用無菌環(huán)從平板上取四分之一個(gè)到1個(gè)純菌落的菌量，混懸于100μl.的純水中。模板提取見取純菌的LB或堿性蛋白胨增菌液1ml.加到1.5mL離心管中，以12000r/min離心2min集菌.去上清液，用1mL生理鹽水或pH7.4的PBS洗一遍，8000r/min離心5min.盡量吸干上清；沉淀物用于模板提取見6.2.3。6.2.2.2黃便和嘔吐物樣本的直接處理直接從糞便和嘔吐物樣本中提取模板時(shí)，可取水樣糞便或嘔吐物約200yl.或200mg,用1ml.PBS(pH7.4)懸浮，2000r/min離心5min,收集上清液于1,5mL.離心管，10000r/min離心5min,盡量吸干上清液；沉淀物用于模板提取見6.2.3。同時(shí)，可對(duì)上述收集的糞便上清液進(jìn)行1:10倍的連續(xù)稀釋2次，10000r/min離心5min.盡量吸干上清液；沉淀物用于模板提取見6.2.3。并將黃便的3種稀釋樣本的DNA模板分別進(jìn)行PCR檢測(cè)。6.2.2.3水樣直接的處理將100mL~500mL水樣用0.2gm濾膜過濾，取濾膜懸浮于1mL~5mL.蒸餾水中，振蕩混勻。樣本可采用不稀釋，1120稀釋和11100稀釋的方法進(jìn)行PCR檢測(cè)。取1mL樣品以12000r/min離心2min集菌，去上清液，沉淀物用于模板提取見6.2.3。6.2.2.4增菌液的處理所有樣本均可按照GB15984和SN/T1239相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行增菌，取增菌液1mL.加到1.5mL離心管中，以12000r/min離心2min集菌，去上清液，用1ml.生理鹽水或pH7.4的PBS洗一遍，8000r/min離心5min,盡量吸干上清液；沉淀物用于模板提取見6.2.3。進(jìn)行霍亂弧菌的監(jiān)測(cè)時(shí)宜采用增菌法，用增菌液提取擴(kuò)增模板。6.2.3.1加熱處理法在沉淀物中加入50μL~100pl.超純水。振蕩混勻，100℃煮沸10min.12000r/min離心5min,上清液即為擴(kuò)增模板。上清液轉(zhuǎn)移并保存在-20℃?zhèn)溆茫?70℃可長(zhǎng)期保存。6.2.3.2酚-氟仿DNA提取法在沉淀物中加入700μLDNA提取液，100℃煮沸10min,加酚：三氯甲烷(1:1,體積比》700pL.,振蕩混勻，12000r/min離心5min,取上清液至另一離心管中，加入等量無水乙醇沉淀DNA,12000r/min離心5min,去上清液，再加入1mL的70%乙醇沖洗一次，12000r/min離心5min,去上清液，室溫晾干，加入50gL～100pL.TE液(或核酸溶解液)溶解沉淀，即為擴(kuò)增模板。保存在-20℃?zhèn)溆茫?70℃可長(zhǎng)期保存。6.2.3.3試劑盒提取純化DNA法按適用于細(xì)菌基因組提取的試劑盒說明書操作。選擇和擴(kuò)增霍亂弧菌的腸毒素基因(ctxA),中心調(diào)節(jié)蛋白基因(toxR),O1群和O139群特異性基因的靶序列各設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，通過PCR技術(shù)，擴(kuò)增出特異性片斷，判斷相應(yīng)基因的存在。6.2.4.2引物和擴(kuò)增產(chǎn)物各基因的PCR檢測(cè)使用以下引物：—ctxA15'-CGGGCAGATTCTAGACCTCC5'-CGATGATCTTGGAGCATTCCCAC-3’(擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度：564hp)——toxR:5'-CCTTCGATCCCC5'-AGGGTTAGCAACGATGCGTAAG-3’(擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度：779bp)——V.choleraeO1:5'-GTTTCACTGAACAGATGGG-3”5*-GGTCATCTGTAAGTACAAC-3’(擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度：192bp)——V.choteraeO139;5*-AGCCTCTTTATTACG5*-GTCAAACCCGATCGTAAAGG-3’(擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度；449bp)以上4對(duì)引物可根據(jù)工作的需要進(jìn)行組合使用，如只選用1對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系按照WS/T230要求進(jìn)行。6.2.4.3陰性對(duì)照、陽性對(duì)照設(shè)置陰性對(duì)照設(shè)為PCR反應(yīng)的空白對(duì)照《以超純水代替DNA模板),陽性對(duì)照采用含有檢測(cè)序列的DNA(或質(zhì)粒)作為PCR反應(yīng)的模板。6.2.4.4多重PCR反應(yīng)體系每個(gè)樣品做2個(gè)平行管，多重PCR反應(yīng)體系如下：——25mmol/L.氯化鎂(MgCl?)4μl;—dNTPs(每種dNTP終濃度為0.2mmol/L)1μL;——引物(每種引物濃度為20gmol/L)1yL;—Tag酶(5U/μL)0.5——超純水補(bǔ)足至50μL。如果所用擴(kuò)增儀沒有熱蓋，可在每管中加石蠟油1滴。以上反應(yīng)體系中氯化鎂(MgCl?)、dNTP、TagDNA聚合酶和引物的終濃度可根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室使用試劑的不同做適當(dāng)調(diào)整，以達(dá)到最佳反應(yīng)體系。6.2.4.5多重PCR反應(yīng)程序循環(huán)參數(shù)為：94C4min,變性模板；然后94C1min.55℃1min.72℃1min,30個(gè)循環(huán)；72C延伸PCR反應(yīng)參數(shù)可根據(jù)基因擴(kuò)增儀型號(hào)的不同進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。6.2.4.6PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電沫檢測(cè)用電泳緩沖液(1×TAE或0.5×TBE)制備2%瓊脂糖凝膠(55C～80C時(shí)加入溴化乙錠至終濃度為0.5pg/mL,也可在電泳后將凝膠浸在含0.5mg/ml溴化乙錠的電泳緩沖液或水中，于室溫30min~45min進(jìn)行染色)。取9pL.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與!pL.上樣緩沖液混勻后上樣，同時(shí)以DNA分子量標(biāo)記物做參照。電泳時(shí)，電壓大小一般控制在3V/tm～5V/cm,電泳緩沖液為1×TAE或0.5×TBE,電泳時(shí)間根據(jù)PCR擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度及溴酚藍(lán)的移動(dòng)位置來確定，電泳檢測(cè)結(jié)果用凝膠成像分析系統(tǒng)記錄并保存或用紫外檢測(cè)儀觀察和記錄。6.2.4.7檢驗(yàn)結(jié)果判斷及意義陰性對(duì)照未出現(xiàn)條帶，陽性對(duì)照出現(xiàn)所有預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，則實(shí)驗(yàn)有效，否則應(yīng)重新做實(shí)驗(yàn)，并排除污染因素。待測(cè)樣品如在某預(yù)期片段大小位置上出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，則可判定該樣品相應(yīng)的基因?yàn)殛栃?；如果待測(cè)樣品未出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，則可報(bào)告該樣品中未檢出預(yù)期大小的基因片斷。——ctxA基因片斷陽性，報(bào)告為“檢出etxA基因片斷(564bp)”——toxR基因片斷陽性，報(bào)告為“檢出toxR基因片斷(779bp)”——01群霍亂弧菌基因片斷陽性，報(bào)告為“檢出O1群霍亂弧菌基因片斷(192bp)”——0139群霍亂弧菌基因片斷陽性，報(bào)告為“檢出O139群霍亂弧菌基因片斷(449bp)”檢測(cè)結(jié)果意義如下：——在霍亂弧菌菌株中檢測(cè)到ctxA基因片斷，表明該待測(cè)霍亂弧菌菌株含ctxA基因，該菌株是一產(chǎn)毒菌株?！诜腔魜y弧菌菌株的樣品中檢測(cè)到預(yù)期大小的擴(kuò)增條帶，只能說明從該待測(cè)樣品中檢測(cè)到某種預(yù)期大小基因片斷，提示可能有相對(duì)應(yīng)的霍亂弧菌存在(見表1),應(yīng)對(duì)該樣品做進(jìn)一步的分離鑒定，霍亂弧菌分離鑒定按GB15984和SN/T1239相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行。 (資料性附錄)試劑、材料和儀器設(shè)備A.1試劑和材料應(yīng)符合GB/T6682中一級(jí)水的規(guī)格。用于PCR的水要使用超純水。A.1.3DNA提取液稱取5gSDS溶于1000ml.TE液中，高壓滅菌備用。包括：氯化鉀(KCl):500mmol/LrTris-HCl(pH8.3》:100mmal/L;明膠r0,1%。A.1.5PCR反應(yīng)液含氯化鎂(MgCl?)的PCR緩沖液、dATP、dTTP、dCTP,dGTP,Tag酶。A.1.6瓊脂糖A.1,710X上樣緩沖液含0,25%溴酚藍(lán)，0.25%二甲苯青FF,30%甘油水溶液。A.1.850XTAE緩沖液稱取484gTris,量取114.2mlL冰乙酸，200ml.0.5mol/LEDTA(pH8.0》,溶于超純水中，定容至2L。分裝后高壓滅菌備用。稱取54gTris.27.5g硼酸，20ml.0.5mol/LEDTA(pH8.0>,定容至1L。A.1.10溴化乙錠(10mg/mL)在100mL超純水中加入1g溴化乙錠，至完全溶解，轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，保存于室溫。A.1.110.5mol/L.EDTA(pH8.0)在800mL超純水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二鈉，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用氫氧化鈉(NaOH)調(diào)節(jié)溶液pH值至8.0,然后定容至1L,分裝后高壓滅菌備用。A.1,12TE緩沖液(pH7,4)0.1mol/l.Tris-HCl(pH7.2)