分離富集新技術(shù)在藥物分析中的研究與應(yīng)用

分離富集新技術(shù)在藥物分析中的研究與應(yīng)用復(fù)雜體系中痕量組分的分離分析是藥物分析工作者面臨的巨大挑戰(zhàn)。為適應(yīng)復(fù)雜體系分析，不僅需要對(duì)待測(cè)組分進(jìn)行分離，還需要對(duì)痕量組分進(jìn)行富集，以提高檢測(cè)靈敏度。傳統(tǒng)的樣品前處理技術(shù)通常以分離或提取待測(cè)組分為目標(biāo)，且普遍存在耗時(shí)長(zhǎng)，操作繁瑣，去除基質(zhì)不完全，靈敏度低等諸多缺點(diǎn)，成為制約分析效率、靈敏度和準(zhǔn)確度的關(guān)鍵問(wèn)題，尋求簡(jiǎn)便、快速，且不降低分析靈敏度或具有富集能力的樣品前處理技術(shù)成為藥物分析領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本課題致力于分離富集新技術(shù)的研究與應(yīng)用，聯(lián)合現(xiàn)代分析檢測(cè)技術(shù)，使樣品不經(jīng)處理或經(jīng)簡(jiǎn)單處理即可進(jìn)樣分析，實(shí)現(xiàn)待測(cè)組分的高靈敏度檢測(cè)，彌補(bǔ)傳統(tǒng)前處理方法的眾多缺點(diǎn)，為藥物分析提供簡(jiǎn)便快速、靈敏準(zhǔn)確的檢測(cè)手段。具體研究如下：(1)傳統(tǒng)離心超濾技術(shù)(Centrifugalultrafiltration，CF-UF)已普遍應(yīng)用于血漿中藥物濃度的測(cè)定，血樣僅需一步離心，即可除去血漿中的大分子內(nèi)源性物質(zhì)，所得超濾液可直接進(jìn)樣分析，簡(jiǎn)便快速。然而，該法在生物大分子基質(zhì)情況下的準(zhǔn)確度系統(tǒng)評(píng)價(jià)未見(jiàn)報(bào)道。課題以二甲雙胍(Metformine，MET)為模型藥物，探索影響CF-UF法和中空纖維離心超濾法(Hollowfibercentrifugalultrafiltration，HFCF-UF)的超濾液體積的因素，比較2種超濾法測(cè)定血藥濃度的準(zhǔn)確度，進(jìn)而完善CF-UF技術(shù)的理論研究，為正確選擇和使用超濾技術(shù)提供理論依據(jù)。研究結(jié)果表明：HFCF-UF超濾液體積不受離心時(shí)間、血漿條件和凍融次數(shù)的影響，HF內(nèi)腔容積可以很好的控制超濾液體積，其測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確度更高。在血漿條件相近的前提下，CF-UF可通過(guò)嚴(yán)格控制離心時(shí)間來(lái)獲得適宜的超濾液體積，以保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。在藥代動(dòng)力學(xué)和生物等效性研究中，血藥濃度的測(cè)定是研究的關(guān)鍵，血漿樣品數(shù)量多，前處理繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，樣品前處理的工作量占全部工作的80%以上，且血漿條件差異較大，有時(shí)會(huì)影響分析結(jié)果的重現(xiàn)性，因此，建立簡(jiǎn)便快速的前處理方法（即可縮短前處理時(shí)間，又可滿足批處理的現(xiàn)代分析要求），保證分析準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性是分析工作者一直追求的目標(biāo)。課題將HFCF-UF法成功應(yīng)用于MET人體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)與生物等效性試驗(yàn)，獲得非常滿意的結(jié)果。該法簡(jiǎn)單快速，重現(xiàn)性好，回收率接近100%，準(zhǔn)確度高，為臨床血樣的快速、準(zhǔn)確分析提供了一種新手段。(2)麻黃堿(Ephedrine，EPH)和N-甲基麻黃堿(N-methylephedrine，MEPH)等藥物具有較強(qiáng)的生理活性，其用藥史的回顧與表征是刑偵司法實(shí)踐中的重要物證資料。血樣、尿樣及毛發(fā)等往往是最常用的生物檢材，隨著藥物體內(nèi)的代謝，待測(cè)組分的濃度迅速降低，因此，提高分析方法的靈敏度，對(duì)延長(zhǎng)檢測(cè)周期、追溯特殊人群的用藥史具有重要意義。課題建立了固相萃取-超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用(SPE-UPLC-MS/MS)的方法，尿樣中EPH和MEPH的檢測(cè)靈敏度達(dá)到0.01ng·mL-1，將生物檢材的檢測(cè)周期延長(zhǎng)到7天，該法前處理簡(jiǎn)單，靈敏度高，為生物樣品中痕量組分的檢測(cè)提供了一種新手段。苯丙胺類(lèi)興奮劑(Amphetamine-typestimulant,ATs)，是法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室常常進(jìn)行篩查和檢測(cè)的非法毒品。由于無(wú)法及時(shí)采集樣品，生物檢材中的ATs含量極低，且基質(zhì)十分復(fù)雜，往往需要對(duì)待測(cè)組分進(jìn)行分離和富集。然而，傳統(tǒng)的樣品前處理方法，如蛋白沉淀法(PPT)、液液萃取法(LLE)，不足以去除生物基質(zhì)，待測(cè)組分的干擾較大，檢測(cè)靈敏度低，無(wú)法滿足復(fù)雜基質(zhì)中痕量組分的檢測(cè)要求。課題將SPE-UPLC-MS/MS技術(shù)成功應(yīng)用于全血中12種非法毒品的檢測(cè)，該法采用酸洗、醇洗和堿洗3步淋洗操作，可有效去除生物基質(zhì)，基質(zhì)效應(yīng)小，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高，可檢測(cè)到ppt級(jí)痕量組分，適用范圍廣，可同時(shí)檢測(cè)多種苯丙胺類(lèi)毒品，為法醫(yī)毒物篩查分析提供了一種可靠、完善、靈敏的法庭物證鑒別手段。(3)頂空氣相色譜法(HS-GC)是將揮發(fā)性組分從樣品基質(zhì)中有效分離后采用氣體進(jìn)樣的分析技術(shù)。它在密閉空間進(jìn)行，既可以避免揮發(fā)性組分的損失，又可以降低樣品基質(zhì)引起的噪音，靈敏度高，分析速度快，操作簡(jiǎn)便。然而，HS-GC技術(shù)常常需要面對(duì)頂空溶劑的選擇問(wèn)題。傳統(tǒng)的頂空溶劑，例如水，沸點(diǎn)較低，其頂空溫度受限，不適宜于高沸點(diǎn)揮發(fā)性成分的頂空分析。而對(duì)于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)等傳統(tǒng)頂空溶劑，溶劑本身的揮發(fā)性形成的分壓會(huì)抑制待測(cè)物的頂空溢出，進(jìn)而影響檢測(cè)靈敏度。離子液體(Ionicliquids，ILs)作為一種新型頂空溶劑應(yīng)運(yùn)而生，其本身具有獨(dú)特的理化性質(zhì)，如溶解性強(qiáng)，幾乎不揮發(fā)，熱穩(wěn)定性好，可設(shè)計(jì)強(qiáng)等特點(diǎn)，拓展了HS-GC技術(shù)在藥物分析中的應(yīng)用范圍。課題建立以ILs作為頂空溶劑的HS-GC法，用于十滴水中樟腦(Camphor,CPH)和桉油精(Eucalyptol,ECP)的含量測(cè)定。該法彌補(bǔ)了傳統(tǒng)頂空溶劑的不足，有效的將高沸點(diǎn)揮發(fā)性成分從復(fù)雜的中藥基質(zhì)中分離出來(lái)，避免了不揮發(fā)或難揮發(fā)性基質(zhì)組分對(duì)色譜系統(tǒng)的污染。ILs-HS-GC法為中藥制劑中高沸點(diǎn)揮發(fā)性成分分析提供了一